金加，沈文龍，李平，張彥，陳昭烈，趙志虎

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)在三維空間上的精確折疊包裝和選擇性表達(dá)決定了細(xì)胞的命運(yùn)，也為各種染色體活動(dòng)（如轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[1-3]）的正常進(jìn)行提供了保障。一維線性染色質(zhì)通過螺旋纏繞和高度折疊最終形成更高級(jí)的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（topologically associating domains，TAD）和A/B區(qū)室。A區(qū)室主要富集H3K4ac、H3K4me1等活躍的組蛋白修飾標(biāo)志，存在高密度的基因分布和復(fù)制起始位點(diǎn)；相反B區(qū)室富含H3K27me3等沉默的組蛋白修飾標(biāo)志，分布的基因較少，另外還有晚期復(fù)制區(qū)域[2-4]。然而這些結(jié)構(gòu)并不是一成不變的，在分化或疾病發(fā)生時(shí)也可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[5-6]。

Isoda等研究發(fā)現(xiàn)核內(nèi)RNA參與了區(qū)室和環(huán)（loop）的形成[7-8]，并且Erdel發(fā)現(xiàn)核內(nèi)RNA可以通過“液相分離”[9]來創(chuàng)建局部細(xì)胞核環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)無膜細(xì)胞器的組裝，進(jìn)而形成更高度有序的核結(jié)構(gòu)，比如核糖體RNA介導(dǎo)的核結(jié)構(gòu)的形成[10-11]。據(jù)報(bào)道，核內(nèi)RNA不僅可以參與形成完整的區(qū)室[12-15]，還參與形成其他核結(jié)構(gòu)域，如剪接因子富集斑點(diǎn)、核仁等[16-19]。如果將核內(nèi)RNA去除，通過電子顯微鏡進(jìn)行顯色觀察發(fā)現(xiàn)高度有序的核結(jié)構(gòu)發(fā)生混亂[14,20]，所以核內(nèi)RNA在核結(jié)構(gòu)的形成中扮演重要的角色。

為了探究核內(nèi)RNA對(duì)染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，我們用全基因組染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（highthroughput/resolution chromosome conformation capture，Hi-C）技術(shù)分析了野生型GM12878細(xì)胞和經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞染色質(zhì)的相互作用，以及A/B區(qū)室和拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

女性B淋巴細(xì)胞GM12878由本室保存。GM12878細(xì)胞存在特殊的X染色體失活現(xiàn)象，是研究核內(nèi)RNA對(duì)染色體三維結(jié)構(gòu)影響的很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。GM12878細(xì)胞已經(jīng)參與了許多組學(xué)研究，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考且便于培養(yǎng)。

RPMI培養(yǎng)基（Hyclone公司）；多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；RNaseA（50 U/mL）、RNaseT1（20 000 U/mL）、Pro Flex PCR System（Life Technologies公司）；RNaseH（5000 U/mL）、HindⅢ-HF（100 U/μL）（NEB公司）；T4DNA連接酶（5 Weiss U/μL）（Thermo Scientific公司）；超聲破碎儀（VCX-750 SONICS）。

1.2 GM12878細(xì)胞的Hi-C實(shí)驗(yàn)

采用Hi-C技術(shù)，分別對(duì)野生型GM12878細(xì)胞和經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將約6×107GM12878細(xì)胞于4℃、500 r/min離心5 min，用2 mL 1×PBS洗滌1次，用4 mL 1×PBS重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞混勻后移入50 mL離心管，在其中加入40 μL 10%甲醛溶液，使其終濃度為1%，在搖床上交聯(lián)10 min，加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸，混勻后在搖床上終止交聯(lián)5 min，4℃、500 r/min離心5 min，棄上清，用裂解液重懸細(xì)胞沉淀后在冰上靜置5 min，再將裂解液移入Dounce管，輕輕上下轉(zhuǎn)動(dòng)管內(nèi)的磨砂玻璃棒20次，然后將野生GM12878細(xì)胞Dounce管中的裂解液直接用5 μLHindⅢ酶切，RNase處理組Dounce管中的裂解液在5 μLHindⅢ酶切的同時(shí)加入 5.2 μL RNaseH、13 μL RNaseA/RNaseT1，4℃、500 r/min離心5 min，棄上清，用2 μL KLenow、2.4 μL 10mmol/L dA/T/GTP、2.4 μL 5 mmol/L生物素標(biāo)記的dCTP、5 μL緩沖液2和39 μL ddH2O補(bǔ)平粘性末端，吹打混勻，在旋轉(zhuǎn)混勻儀上于23℃混勻4 h，補(bǔ)平體系，500 r/min離心3 min，棄上清，加入215 μL ddH2O、25 μL T4DNA連接酶緩沖液洗滌1次，用10 μL T4DNA連接酶于16℃連接8 h，然后用蛋白酶K解交聯(lián)，超聲打斷后，進(jìn)行建庫二代測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

首先將得到的Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，分別進(jìn)行文庫過濾統(tǒng)計(jì)、文庫比對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和文庫有效數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別繪制全基因組相互作用熱圖、全基因組相互作用衰減指數(shù)（interaction decay exponents，IDE）比較分析、差異熱圖比較分析、統(tǒng)計(jì)A、B區(qū)室差異并采用GO注釋進(jìn)行功能分析。此外，對(duì)染色體之間的相互作用（秩和檢驗(yàn)P＜0.05）和TAD邊界強(qiáng)度進(jìn)行比較分析（Vilcox檢驗(yàn)P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 Hi-C數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

在文庫過濾統(tǒng)計(jì)中（圖1A），野生型GM12878末端完全配對(duì)片段占比97.92%，經(jīng)RNase處理的GM12878末端完全配對(duì)片段占比98.43%，2組文庫的完全配對(duì)片段占比較高。文庫比對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（圖1B），與參考文庫相比，野生型GM12878文庫惟一配對(duì)片段占比74.65%，經(jīng)RNase處理的GM12878文庫惟一配對(duì)片段占比73.52%，沒有配對(duì)的其他類型片段占比較低，2組文庫樣本質(zhì)量較好。2組文庫有效數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)（圖1C），野生型GM12878文庫相互作用片段占比95.45%，其中有效相互作用片段占比82.09%，在RNase處理的GM12878文庫中，相互作用占比95.09%，其中有效相互作用74.1%，表明Hi-C實(shí)驗(yàn)質(zhì)量較高。

2.2 核內(nèi)RNA對(duì)染色體相互作用的影響

野生型GM12878染色體內(nèi)相互作用熱圖（圖2A）和RNase處理后的GM12878染色體相互作用熱圖（圖2B）中的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)代表同一染色體的不同堿基位置，圖中的紅點(diǎn)代表了染色體兩位置之間存在較強(qiáng)的相互作用，紅色越強(qiáng)表示相互作用的強(qiáng)度越大。野生型GM12878和RNase處理的GM12878染色體內(nèi)部的相互作用呈現(xiàn)出一樣的相互作用狀態(tài)，都是區(qū)室內(nèi)部的相互作用大于區(qū)室之間的相互作用。

圖1 Hi-C數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

為了比較野生型GM12878和RNase處理的GM12878染色體內(nèi)部的相互作用差異，將野生型GM12878染色體內(nèi)相互作用減扣RNase處理的GM12878染色體內(nèi)相互作用。圖3橫縱坐標(biāo)分別代表同一染色體上的不同位置，圖內(nèi)紅點(diǎn)代表野生型GM12878相互作用更強(qiáng)，藍(lán)點(diǎn)代表RNase處理的GM12878相互作用更強(qiáng)。相比于近距離的染色質(zhì)內(nèi)相互作用，染色體內(nèi)遠(yuǎn)距離的相互作用有更多的改變。這也表明核內(nèi)RNA在遠(yuǎn)距離的相互作用上起到了更重要的作用。

我們繪制了全基因組IDE曲線（圖4），隨著基因距離的不斷增大，野生型GM12878和RNase處理的GM12878細(xì)胞的相互作用頻率由10-6下降到10-8，其中RNase處理組在基因距離108堿基對(duì)處的相互作用頻率略高于野生型GM12878，說明相比于野生型GM12878細(xì)胞，經(jīng)RNase處理后的GM12878細(xì)胞的染色體遠(yuǎn)距離相互作用有所增強(qiáng)，染色體的結(jié)構(gòu)變得松散。

圖2 X染色質(zhì)相互作用熱圖

圖3 染色質(zhì)內(nèi)相互作用的減扣

圖4 染色質(zhì)相互作用衰減指數(shù)

除此之外，我們還比較了2組細(xì)胞的染色體之間的相互作用（圖5），RNase處理的GM12878細(xì)胞染色體間相互作用分?jǐn)?shù)高于野生型GM12878細(xì)胞（秩和檢驗(yàn)P＜0.05）。這也說明經(jīng)過RNase處理的GM12878細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散。

2.3 核內(nèi)RNA對(duì)A/B區(qū)室的影響

為了進(jìn)一步分析核內(nèi)RNA對(duì)區(qū)室的影響，我們統(tǒng)計(jì)了2組GM1287細(xì)胞在A/B區(qū)室上的變化。所有染色體A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例餅圖（圖6A）中，A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室占比0.51%，B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室占比0.62%，未發(fā)生變化的A區(qū)室占比48.38%，未發(fā)生改變的B區(qū)室占比50.48%。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室所占比例高于A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室。將發(fā)生轉(zhuǎn)變區(qū)室上的基因進(jìn)行GO注釋功能分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)變區(qū)塊中，A區(qū)室轉(zhuǎn)變成B區(qū)室上的基因在功能上主要和脫氫酶相關(guān)，B區(qū)室轉(zhuǎn)變成A區(qū)室上的基因在功能上主要和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分相關(guān)。在X染色體A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例餅圖（圖6B）中，A區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锽區(qū)室占比1.45%，B區(qū)室轉(zhuǎn)變?yōu)锳區(qū)室占比1.45%，未發(fā)生變化的A區(qū)室占比47.98%，未發(fā)生改變的B區(qū)室占比49.12%，所以相比于所有染色體的變化，X染色體上發(fā)生變化的A/B區(qū)室的比例更高。由于GM12878是女性淋巴細(xì)胞，含有2條X染色體，其中一條由于核內(nèi)非編碼RNA Xist的緊密纏繞而處于壓縮狀態(tài)，我們認(rèn)為RNase的處理導(dǎo)致緊密的X染色體變得松散，所以相比于所有染色體A/B區(qū)室的變化，X染色體的A/B區(qū)室變化更大。對(duì)編碼Xist基因的74M左右區(qū)域進(jìn)行染色體相互作用分析（圖7），野生型GM12878細(xì)胞Xist基因位置的相互作用減扣RNase處理的GM12878細(xì)胞Xist位置的相互作用顯示藍(lán)色增多，說明相比于野生型GM12878細(xì)胞，RNase處理后GM12878細(xì)胞的相互作用更弱。

圖5 染色質(zhì)之間的相互作用比較（*P＜0.05）

圖6 A/B區(qū)室轉(zhuǎn)變比例

2.4 核內(nèi)RNA對(duì)TAD邊界強(qiáng)度的影響

為了觀察RNase處理后TAD邊界強(qiáng)弱的變化，將野生型GM12878和RNase處理的GM12878細(xì)胞的TAD邊界的強(qiáng)弱進(jìn)行比較（圖8），發(fā)現(xiàn)相比于野生型GM12878細(xì)胞，經(jīng)RNase處理的GM12878細(xì)胞的TAD邊界強(qiáng)度較?。╒ilcox校驗(yàn)P＜0.05）。這是因?yàn)橛捎诤藘?nèi)RNA參與了loop形成，經(jīng)RNase處理，導(dǎo)致環(huán)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響TAD結(jié)構(gòu)變得松散，從而減弱了TAD邊界強(qiáng)度。

3 結(jié)論

圖7 X染色體74M左右區(qū)域相互作用熱圖

圖8 TAD邊界強(qiáng)弱變化

我們證實(shí)了核內(nèi)RNA對(duì)真核細(xì)胞染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)是有影響的，RNA的去除導(dǎo)致真核細(xì)胞染色體三維高級(jí)結(jié)構(gòu)在整體上變得松散，A/B區(qū)室發(fā)生改變，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA可以通過結(jié)合RNA結(jié)合蛋白對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行修飾，進(jìn)而調(diào)控染色質(zhì)環(huán)的形成，核內(nèi)RNA還參與了TAD邊界的形成和建立，而RNase處理導(dǎo)致了環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，TAD邊界強(qiáng)度減弱?；蚪M染色體三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是表觀遺傳的關(guān)鍵，受到許多物質(zhì)的調(diào)控，如核內(nèi)RNA、蛋白質(zhì)、激素等。如果基因組的三維結(jié)構(gòu)或者調(diào)控出現(xiàn)了偏差，有可能導(dǎo)致疾病。我們認(rèn)為在未來會(huì)研發(fā)出一些更好的分子生物實(shí)驗(yàn)，特別是研究核內(nèi)RNA對(duì)染色質(zhì)三維高級(jí)結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)修飾物影響的實(shí)驗(yàn)，這對(duì)于揭示基因組三維高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的潛在原理至關(guān)重要。