竇俊，方宏清，徐登圓，趙珊珊，陳慧梅，徐曉峰，支艷艷，李曉穩(wěn)，文良柱

1.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；2.江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004；3.江蘇萬新醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215000

巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，曾稱Pichia pastoris）是一種常用的甲基營養(yǎng)型酵母，近年來成為備受關(guān)注的外源蛋白真核表達系統(tǒng)[1]，成功表達了超出5000個外源蛋白[2]。美國FDA于2006年批準畢赤酵母是安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS）[3]，其被廣泛用于表達酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)節(jié)蛋白等多種外源蛋白[4-5]。相比原核表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)具有篩選方法成熟[6]、生長快、外源蛋白表達量高、穩(wěn)定性好[7]、可翻譯后加工修飾[8]、可基因改造[9]、產(chǎn)物可分泌、可高密度發(fā)酵[10]等優(yōu)點。

啟動子是外源蛋白表達系統(tǒng)中影響外源蛋白高效表達的重要基因表達調(diào)控的順式元件。其中，醇氧化酶 1（alcohol oxidase 1，AOX1）基因的啟動子PAOX1是畢赤酵母表達系統(tǒng)最常用的甲醇誘導(dǎo)型表達的強啟動子[11]，廣泛用于酵母的高密度、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，表達了眾多外源蛋白。

但是，嚴格受甲醇誘導(dǎo)表達的啟動子PAOX1仍有一些不足之處。甲醇易揮發(fā)，大規(guī)模補料控制工藝復(fù)雜[12]，操作過程不便；高濃度的甲醇易燃，可能有火災(zāi)的安全隱患[13]；甲醇有毒，不宜于飼料工業(yè)、食品、醫(yī)藥等蛋白生產(chǎn)，容易污染環(huán)境。

目前，甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAP）啟動子和 pYPT1（GTP酶）啟動子是應(yīng)用較為廣泛的組成型啟動子。PGAP可利用的碳源有葡萄糖、甘油、甲醇和油酸等，克服了PAOX1啟動子的缺陷，高水平組成表達相當甚至高于PAOX1表達系統(tǒng)的外源蛋白[14]。比起PAOX1的誘導(dǎo)型表達，使用PGAP的組成型表達不需要補加甲醇進行誘導(dǎo)，避免了甲醇帶來的危害，且操作方便，大大縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率[15]，更適合大規(guī)模連續(xù)表達外源蛋白[16]，應(yīng)用前景廣闊。

黃鵬等[8]利用PGAP在畢赤酵母中表達了高純度和高活性的重組人鵝型溶菌酶2（rhLysG2）；Yang等通過PGAP表達了堿性植酸酶[17]；方煒等[18]構(gòu)建菌株 GS115（pGAP9K-AMPD），表達了 AMP脫氨酶；王金菊等[19]構(gòu)建畢赤酵母GS115（pGAP9-16BMP）進行組成型表達，得到了目的產(chǎn)物豬肉風味強化肽。

胰蛋白酶原可被腸激酶或胰蛋白酶自身激活成為活化的胰蛋白酶[20]。胰蛋白酶的相對分子質(zhì)量為 2.3×104～2.4×104，能專一性水解多肽鏈中賴氨酸和精氨酸C端形成的肽鍵。胰蛋白酶在皮革處理、食品加工、醫(yī)藥、臨床診斷、蛋白質(zhì)組學和重組胰島素的生產(chǎn)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[21]。傳統(tǒng)工藝從動物（豬、豬等）胰臟中提取的胰蛋白酶純度低，可能攜帶病原體或病毒，易發(fā)生自溶[22]，價格昂貴，在制藥行業(yè)中應(yīng)用受限[23]。在大腸桿菌和畢赤酵母中表達的重組胰蛋白酶原[24]，無外源性病毒污染，無雜酶，酶切反應(yīng)的特異性較高，無其它副反應(yīng)[25]，解決了上述問題。徐曉峰等通過構(gòu)建含胰蛋白酶原基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），以包涵體形式表達，經(jīng)過變性復(fù)性和激活后得到了胰蛋白酶[26]；汪曉娟等構(gòu)建了啟動子為PAOX1的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，誘導(dǎo)表達獲得了豬胰蛋白酶[20]。

本實驗中，我們采用基因重組技術(shù)，利用PGAP組成型啟動子，無需添加甲醇誘導(dǎo)，實現(xiàn)了豬胰蛋白酶原基因在畢赤酵母X33中的重組分泌表達，獲得了活性較高的重組豬胰蛋白酶，簡化了操作，縮短了表達周期，提升了效率，避免了動物源性污染，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和畢赤酵母X33均為本實驗室保藏；質(zhì)粒pGAP-PT、pGAP-PT1、pGAP1-PT1、pGAP2-PT1、pGAP3-PT1、pGAP4-PT1為組成型表達胰蛋白酶原或其突變體的酵母表達載體，委托南京金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建，由本實驗室保存。

限制性內(nèi)切酶AvrⅡ（New England BioLabs）；CaCl2、山梨醇、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽、磷酸、乙腈（國藥集團）；博來霉素（zeocin，Invitrogen）；瓊脂糖（Generay Biotech）；LB抗性培養(yǎng)基含25 μg/mL博來霉素；YPD抗性培養(yǎng)基含 100 μg/mL博來霉素。

組合式搖床（Qiang Le）；高速落地冷凍離心機（Thermo Scientific）；紫外分光光度計UV-2450、基因?qū)雰xSCIENTZ-2C（寧波新芝）；生物超凈工作臺（SUKUN）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）；?KTAexplorer（GE）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；吸光度酶標儀Apollo 11 LB913（Berthold Technologies Bioanalytic）；LC-MS（安捷倫）；苯甲醚親和層析柱、SP離子交換柱（中科森輝）；HPLC儀（島津）。

1.2 質(zhì)粒擴增

將質(zhì)粒采用冷CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含25 μg/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)至菌落形成。篩選陽性克隆點到LB液體培養(yǎng)基中，以37℃、250 r/min的條件培養(yǎng)約16 h，用40%甘油于-20℃保存菌種，并轉(zhuǎn)接20 μL菌液至200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)約16 h。

1.3 質(zhì)粒提取、線性化與回收

采用NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA-REF 740410.50質(zhì)粒中抽試劑盒提取上述菌液的質(zhì)粒，測定質(zhì)粒含量，并取 20 μg質(zhì)粒，加入 6 μLAvrⅡ酶，建立總體積為400 μL的線性化酶切體系，37℃孵育2 h。

取少量樣品進行DNA瓊脂糖電泳驗證，結(jié)果符合要求后用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0-Cat.9761試劑盒回收，最后一步用ddH2O洗脫。

1.4 畢赤酵母X33感受態(tài)制備

具體方法參見文獻[27-28]。

1.5 畢赤酵母X33的電擊轉(zhuǎn)化和篩選

用基因?qū)雰x將構(gòu)建的載體與畢赤酵母X33感受態(tài)細胞混合，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，冰浴5 min，將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)儀中，啟動RD鍵開始電擊。轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即加入1 mol/L冰冷的山梨醇1 mL，涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板進行篩選，30℃培養(yǎng)2～4 d至長出單菌落。

1.6 SDS-PAGE分析

篩選單菌落到3 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、280 r/min培養(yǎng)20～22 h，按起始D600nm為0.05轉(zhuǎn)接到50 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min培養(yǎng)48 h，取1 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心3 min，取上清加非還原處理液進行SDS-PAGE，觀察結(jié)果。

1.7 活性測定

首先采用紫外-可見分光光度法測定濃度。以 0.01 mol/L HCl、0.02 mol/L CaCl2（pH2.0±0.2）緩沖液為空白對照，將樣品用緩沖液溶解或稀釋至約0.5 mg/mL，取光程為1 cm的帶蓋石英比色杯，測定D280nm值。按下式計算蛋白濃度：

式中，df為供試品稀釋倍數(shù)，D280nm為供試品溶液在280 nm下扣除空白對照后的吸收值。

然后采用BAEE法，參照中國藥典2015版2部[29]測定酶活力。含有0.25 mmol/L BAEE底物的磷酸鹽緩沖液，光程1 cm，波長253 nm，溫度25.0±0.5℃，測量體積3.2 mL條件下吸光值每分鐘改變0.003相當于1個酶活力單位。

1.8 胰蛋白酶的純化

活化后的菌種按起始D600nm為0.2轉(zhuǎn)接到含1 L YPD的5 L錐形瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，5000 r/min離心15 min收集上清液，設(shè)置UV檢測波長280 nm，用SP-FF離子交換介質(zhì)捕獲胰蛋白酶原，然后加入腸激酶進行激活得到胰蛋白酶，再通過苯甲醚親和層析得到純度較高的胰蛋白酶。

1.9 HPLC分析

1.9.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合多孔硅膠填充色譜柱（ODS柱），柱直徑4.6 mm，長25 cm；粒度 3 μm，孔徑200 ?，柱溫40℃。流動相A液為水+0.1%磷酸，B液為乙腈+0.1%磷酸，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm。洗脫梯度為 0→25→30→34min→35→45 min，對應(yīng)時間點的流動相B為25%→45%→90%→90%→25%→25%。α胰蛋白酶和β胰蛋白酶的分離度應(yīng)不小于1。

1.9.2 供試品溶液制備 取適量重組胰蛋白酶，用 0.01 mol/L HCl、0.02 mol/L CaCl2（pH2.0±0.2）溶液配制成70±10 mg/mL，轉(zhuǎn)移至HPLC進樣瓶。

1.9.3 測定法 取供試品溶液1 μL注入液相色譜儀，Chromeleon 7.2記錄色譜圖。面積歸一化法計算胰蛋白酶純度，積分時間為25 min，扣除空白對照。α胰蛋白酶如有前肩峰采用垂直積分，β胰蛋白酶如有拖尾峰采用切線積分，β胰蛋白酶不低于70%，α胰蛋白酶不高于20%。

1.10 胰蛋白酶LC-MS分析

采用液質(zhì)聯(lián)用儀進行質(zhì)譜分析。流動相A為超純水+0.1%甲酸，B為ACN+0.1%甲酸。色譜柱為 Sepax Bio-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，300 ?。流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長214 nm。洗脫梯度為0→35→37→38→40 min，對應(yīng)時間點的流動相B為10%→90%→90%→10%→10%。

2 結(jié)果

2.1 豬胰蛋白酶原及其突變體的組成型表達菌株篩選

篩選到的8株X33/pGAP-PT菌株表達上清的SDS-PAGE顯示其中7株在相對分子質(zhì)量25×103附近有目的蛋白表達，菌株X33/pGAP-PT2和X33/pGAP-PT3表達比較明顯（圖1），考馬斯亮藍法測得X33/pGAP-PT3表達上清濃度為0.088 mg/mL，腸激酶激活后的酶活為39 U/mL。

篩選到的突變體菌株X33/pGAP-PT1表達上清在相對分子質(zhì)量25×103附近有明顯的目的蛋白（圖2）?？捡R斯亮藍法測得X33/pGAP-PT1-1表達上清濃度為0.115 mg/mL，腸激酶激活后的酶活為130 U/mL，提高了胰蛋白酶原的表達量（圖3）和酶活性。

2.2 不同啟動子對表達的影響

圖1 X33/pGAP-PT表達上清的SDS-PAGE

圖2 X33/pGAP-PT1表達上清的SDS-PAGE

突變體在胰島素原酶切實驗中胰島素得率較高，因此，我們研究了使用 PGAP、PGAP1、PGAP2、PGAP3和PGAP4啟動子的突變體的胰蛋白酶原表達情況。不同啟動子突變體的表達上清SDS-PAGE顯示有目的蛋白表達，且X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP4-PT1表達明顯（圖4）。X33/pGAP1-PT1表達上清蛋白含量最高，考馬斯亮藍法測得濃度為0.123 mg/mL，證明更換的PGAP1啟動子提高了胰蛋白酶原的表達量。

2.3 活性測定

分別將 X33/pGAP-PT、X33/pGAP-PT1、X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP2-PT1、X33/pGAP3-PT1 和X33/pGAP4-PT1甘油菌種活化后按D600nm為0.05轉(zhuǎn)接到50 mL YPD中，30℃、250 r/min培養(yǎng)48 h，離心取上清，加腸激酶激活，BAEE法測上清酶活性，用UV-2450及配套軟件采集數(shù)據(jù)（圖5）。X33/pGAP-PT、X33/pGAP-PT1、X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP2-PT1、X33/pGAP3-PT1、X33/pGAP4-PT1表達的胰蛋白酶活性依次為39、130、142、72、62、91 U/mL，X33/pGAP1-PT1最高，證明更換的PGAP1啟動子提高了胰蛋白酶活性。

2.4 胰蛋白酶的純化

將X33/pGAP1-PT1進行5 L發(fā)酵，離心取上清，對表達上清的胰蛋白酶原進行捕獲、激活和純化，從色譜圖（圖6）可以看到，通過苯甲醚親和層析得到了純度較高的胰蛋白酶，測得濃度為0.94 mg/mL，比活6365 U/mg，活性5983 U/mL。

圖3 X33/pGAP-PT與X33/pGAP-PT1上清SDS-PAGE對比

圖4 X33不同啟動子表達上清的SDS-PAGE

2.5 HPLC分析

對X33/pGAP1-PT1純化后的樣品進行HPLC分析，主峰保留時間15.387 min，首先被洗脫出來的是α胰蛋白酶，且不高于20%，然后是β胰蛋白酶，且不低于70%，分離度不小于1（圖7）。

2.6 胰蛋白酶的LC-MS分析

圖5 BAEE法酶活曲線

對X33/pGAP1-PT1純化后的樣品進行LC-MS分析，質(zhì)譜測定的相對分子質(zhì)量為23464.08，根據(jù)氨基酸序列推測的相對分子質(zhì)量為23475.62。考慮到分子中有6對二硫鍵，相對分子質(zhì)量減少12，所以理論值為23463.62，測定值與理論值基本一致（圖8）。

圖6 X33/pGAP1-PT1純化圖

圖7 胰蛋白酶的HPLC圖

圖8 X33/pGAP1-PT1的LC-MS圖

3 討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)由于自身優(yōu)勢被廣泛用于表達各種外源蛋白，本研究采用PGAP組成型啟動子，避免了甲醇的使用，安全方便。胰蛋白酶是常用的消化酶，在重組胰島素生產(chǎn)等領(lǐng)域起重要作用。本研究實現(xiàn)了豬胰蛋白酶原在巴斯德畢赤酵母X33中的高效組成型表達，而且產(chǎn)物活性較高，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

利用畢赤酵母表達系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵，經(jīng)過簡單幾步純化即可獲得高純度的胰蛋白酶，同時有效避免了動物源性污染。在蛋白質(zhì)組學中，通常需要序列級的胰蛋白酶來特異性切割蛋白質(zhì)為多肽，因此選擇合適的胰蛋白酶非常重要。胰蛋白酶還可用作藥物，其注射劑能消化溶解變性蛋白，但對正常組織不起作用，臨床應(yīng)用中能使膿液、瘤液、血凝塊被分解，使引流通暢，創(chuàng)面加速凈化，新生肉芽組織生長，還可分解破壞多種毒蛇毒液中的蛋白質(zhì)用于解蛇毒。綜上所述，本研究有較好的經(jīng)濟效益和應(yīng)用前景。