劉 震，徐玉鵬，黃 偉，黃素芳，王秀領(lǐng)，趙忠祥，閻旭東*

（1滄州市農(nóng)林科學(xué)院，河北滄州 061001；2滄州市科技創(chuàng)新服務(wù)中心，河北滄州 061001）

土壤中種類繁多且具有不同功能特性的微生物，是生態(tài)系統(tǒng)中最重要和活躍的組成部分及土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力［1，2］，也是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力的重要指標(biāo)［3］。土壤微生物不僅參與了土壤礦質(zhì)元素循環(huán)、有機(jī)質(zhì)形成和發(fā)展以及自然環(huán)境掉落物的腐解過(guò)程，而且在植物生長(zhǎng)發(fā)育及作物病蟲(chóng)害防治方面也有重要作用［4，5］。

苜蓿是多年生豆科植物，因其產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)豐富被稱為“牧草之王”，已作為一種優(yōu)質(zhì)的牧草在我國(guó)大面積種植［6］。在土壤貧瘠地區(qū)進(jìn)行苜蓿栽培既可以解決當(dāng)?shù)厣箫暳蠁?wèn)題，同時(shí)又可以利用苜蓿廣泛的適應(yīng)性改善土壤理化性質(zhì)，具有較高的生態(tài)效益［7，8］。賈倩民等［9］研究表明，干旱區(qū)鹽堿地栽培苜蓿可以降低土壤容重及pH值，提高土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量。楊珍平等［10］通過(guò)根管土柱試驗(yàn)研究了苜蓿對(duì)黃土母質(zhì)生土的影響，發(fā)現(xiàn)土壤經(jīng)過(guò)苜蓿根際穿插、切割和擠壓作用，促進(jìn)了土壤孔隙度的增加，同時(shí)提高了土壤酶活性，使土壤肥力水平向有利于作物生長(zhǎng)的方向發(fā)展。張寶泉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，隨著紫花苜蓿連作年限增加，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷等養(yǎng)分指標(biāo)增加，而主要養(yǎng)分與微生物生物量之間存在一定的相關(guān)性。但由于常用的土壤微生物多樣性研究方法如DNA重組、DNA-DNA雜交、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）等無(wú)法用于詳細(xì)分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成［12］，而且目前苜蓿栽培與生態(tài)環(huán)境間關(guān)系的相關(guān)研究較少。因此本研究采用二代高通量測(cè)序技術(shù)，從細(xì)菌和真菌群落構(gòu)成、土壤環(huán)境因子及二者相互關(guān)系等方面探討苜蓿連作對(duì)黑龍港地區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，從生態(tài)角度闡述苜蓿連作改善土壤環(huán)境的部分機(jī)理，為推動(dòng)苜蓿種植、全面發(fā)展草產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤

供試土壤為4年生苜蓿根際土壤（Y4），于2018年7月15日取自河北省滄州市獻(xiàn)縣北張白村滄州市農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地（116.36°E，38.31°N）。選取緊鄰研究對(duì)象的未耕作土壤作為對(duì)照（YO）。根據(jù)5點(diǎn)取樣法，每處理按照梅花形確定5個(gè)采樣點(diǎn)，選取生長(zhǎng)良好的苜蓿樣品，去除其周邊及表層雜草后，用抖落法取水平深度0～20 cm苜蓿根際土壤約10 g。將5個(gè)采樣點(diǎn)的土壤充分混勻后，采用四分法選取1份土壤樣品裝入無(wú)菌密封袋，放入裝有干冰的泡沫箱中。每個(gè)處理3次重復(fù)，待全部樣品采集完成后置于超低溫冰箱-80℃保存待測(cè)。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

分別采用重鉻酸鉀法、堿解擴(kuò)散法、Olsen法和火焰光度法測(cè)定有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量；采用酸度計(jì)電位法測(cè)定pH值。

1.3 苜蓿根際微生物多樣性測(cè)定

采用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)苜蓿根際土壤樣品中微生物的DNA特定長(zhǎng)度（區(qū)域）PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。具體操作步驟為：將土壤提取基因組后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA提取質(zhì)量，采用NanoDrop-ND1000測(cè)定總DNA濃度。采用引物（F1：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，R1：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增細(xì) 菌16S rDNA基因V3+V4區(qū)域，采用引物（F2：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域，回收PCR產(chǎn)物并測(cè)定濃度后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由北京百邁客科技有限公司采用Illumina-HiSeq平臺(tái)完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH V1.2.7軟件通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到拼接序列數(shù)據(jù)（Raw Tags），再采用Trimmomatic V0.33軟件，對(duì)拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，最后采用UCHIME V4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）用于信息分析。采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿連作對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，種植苜蓿會(huì)對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。同對(duì)照（Y0）相比，連作4年苜蓿（Y4）土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量提高了54.33%和24.93%，pH值和有效磷含量降低了4.80%和32.36%，且變化幅度均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。土壤速效鉀含量雖有變化，但未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。通過(guò)種植苜蓿降低了土壤pH值，減少了土壤鹽漬化，同時(shí)提高了土壤有機(jī)質(zhì)及堿解氮含量，起到了改善土壤環(huán)境的作用。

表1 不同處理土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil in different treatments

2.2 苜蓿連作對(duì)土壤微生物指數(shù)的影響

樣品經(jīng)過(guò)雙端Reads拼接、過(guò)濾后，2處理根際土壤細(xì)菌V3+V4區(qū)域獲得有效序列338 043條，真菌ITS區(qū)獲得有效序列324 888條，樣品覆蓋度均高于99.95%，符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。按照樣品97%相似度水平劃分OTUs，并統(tǒng)計(jì)ACE、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，結(jié)果列于表2。

從表2可見(jiàn)，與對(duì)照相比，Y4處理細(xì)菌及真菌OTUs數(shù)量分別增加了21.05%和19.06%，說(shuō)明通過(guò)種植苜蓿，可以增加土壤環(huán)境中微生物種類。比較細(xì)菌及真菌ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)后可以發(fā)現(xiàn)，2個(gè)指數(shù)規(guī)律與OTUs相似，說(shuō)明Y4處理土壤中細(xì)菌及真菌相對(duì)豐度（即微生物數(shù)量）均高于Y0處理。細(xì)菌及真菌Simpson指數(shù)表現(xiàn)為Y0大于Y4，Shannon指數(shù)則相反，也說(shuō)明Y4樣品的物種多樣性高于對(duì)照Y0。由此可見(jiàn)，苜蓿連作后土壤根際微生物數(shù)量及種類均在一定程度上得到提高。

表2 根際土壤微生物多樣性指數(shù)Table 2 Soil microbial diversity index

2.3 苜蓿連作對(duì)土壤細(xì)菌群落構(gòu)成的影響

根據(jù)細(xì)菌分類相對(duì)豐度排名前10名結(jié)果（表3），門(mén)水平上Y0處理和Y4處理細(xì)菌群落構(gòu)成相似，前10名分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）。變形菌門(mén)和酸桿菌門(mén)在Y0和Y4 2個(gè)處理中相對(duì)豐度均大于10%，其他細(xì)菌在Y0處理中相對(duì)豐度為1%～10%；而Y4處理除放線菌門(mén)（13.16%）外，其他7個(gè)細(xì)菌門(mén)類相對(duì)豐度均小于10%。與對(duì)照Y0相比，Y4處理酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和疣微菌門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度增加，分別提高了4.49、6.39、1.27、0.91和0.26個(gè)百分點(diǎn)；變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)和浮霉菌門(mén)細(xì)菌則低于對(duì)照，相對(duì)豐度分別降低了7.63、3.13、3.08、0.15和0.06個(gè)百分點(diǎn)。

將相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌按類別進(jìn)行劃分，其余部分劃為其他及未分類，可組成綱水平上的細(xì)菌分類。由表3可知，Y0中除α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）外，其余細(xì)菌群落豐度均小于8%；Y4中除α-變形菌綱外，其余細(xì)菌群落均小于8%。2處理中α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和Subgroup_6等細(xì)菌群落相對(duì)豐度均大于5%，但芽胞桿菌綱在Y0土壤中的相對(duì)豐度為5.46%，在Y4土壤中僅2.87%。總體上看，與Y0相比，Y4土壤中相對(duì)豐度提高20%以上的細(xì)菌群落有芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）、放線菌綱（Actinobacteria）、Blastocatellia、Subgroup_6；相對(duì)豐度降低20%以上的細(xì)菌群落有γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、芽胞桿菌綱（Bacilli）和鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）。

表3 細(xì)菌群落構(gòu)成 %Table 3 Bacterial community composition

2.4 苜蓿連作對(duì)土壤真菌群落構(gòu)成的影響

從門(mén)水平上的真菌分類結(jié)果上看（表4），按照相對(duì)豐度由高到低排列，土壤中主要存在10個(gè)真菌門(mén)，分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、新美鞭菌門(mén)（Neocallimastigomycota）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycota）、絲足蟲(chóng)門(mén)（Cercozoa）和Aphelidiomycota。其中，Y0土壤中，子囊菌門(mén)真菌相對(duì)豐度較高，占58.90%；其次為擔(dān)子菌門(mén)真菌，占12.11%。Y4土壤中，子囊菌門(mén)真菌相對(duì)豐度為66.14%，比對(duì)照高12.29%；擔(dān)子菌門(mén)真菌相對(duì)豐度為10.36%，較對(duì)照低14.45%；新美鞭菌門(mén)、毛霉門(mén)、球囊菌門(mén)、壺菌門(mén)、油壺菌門(mén)和Cercozoa相對(duì)豐度分別比對(duì)照高37.89%、34.43%、59.09%、4.0%、42.86%和225.0%；Aphelidiomycota相對(duì)豐度則比對(duì)照低80.0%；被孢霉門(mén)相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。

2個(gè)處理中，綱水平上糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）和酵母菌綱（Saccharomycetes）相對(duì)豐度均大于5%，為根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌種；錘舌菌綱（Leotiomycetes）、新囊菌 綱（Neocallimastigomycetes）、孢霉綱（Mortierellomycetes）、毛霉綱（Mucoromycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）和節(jié)擔(dān)菌綱（Wallemiomycetes）相對(duì)豐度為1%～4%。與Y0相比，Y4土壤中糞殼菌綱、散囊菌綱、新囊菌綱、孢霉綱、傘菌綱和節(jié)擔(dān)菌綱真菌群落相對(duì)豐度均提高了17.55%～37.97%；座囊菌綱、酵母菌綱、錘舌菌綱和毛霉綱真菌則降低了0.08%～21.77%?？梢?jiàn)，連作苜蓿4年后，根際土壤間真菌群落構(gòu)成發(fā)生了較大變化。

表4 真菌群落構(gòu)成 %Table 4 Fungal community composition

2.5 微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

為了闡明環(huán)境因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，在門(mén)水平上對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌與土壤環(huán)境因子間的相關(guān)性進(jìn)行了分析（表5）。結(jié)果表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，變形菌門(mén)與pH呈負(fù)相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)（以下簡(jiǎn)稱OM）、堿解氮（以下簡(jiǎn)稱AN）、有效磷（以下簡(jiǎn)稱AP）和速效鉀（以下簡(jiǎn)稱AK）呈正相關(guān)，硝化螺旋菌門(mén)的結(jié)果則相反，為負(fù)相關(guān)；酸桿菌門(mén)和放線菌門(mén)與pH、OM、AN和AK呈負(fù)相關(guān)，與AP呈正相關(guān)；芽單胞菌門(mén)除與pH及AP呈正相關(guān)外，與其余環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；擬桿菌門(mén)同各環(huán)境因子均呈正相關(guān)，綠彎菌門(mén)結(jié)果同前者相反；厚壁菌門(mén)與pH、OM和AN呈正相關(guān)，與AP和AK呈負(fù)相關(guān)；疣微菌門(mén)與pH和OM呈負(fù)相關(guān)，與AN、AP和AK呈正相關(guān)；浮霉菌門(mén)除與OM呈正相關(guān)外，與其余環(huán)境因子均呈負(fù)相關(guān)。因此，OM、AN和AK等環(huán)境因子是與細(xì)菌群落變化相關(guān)性較大的土壤理化指標(biāo)。

而在真菌群落結(jié)構(gòu)中，子囊菌門(mén)與pH、AN和AK呈正相關(guān)，與OM和AP呈負(fù)相關(guān)；擔(dān)子菌門(mén)除與AP呈負(fù)相關(guān)外，與其余環(huán)境因子均呈正相關(guān)；被孢霉門(mén)與pH和OM呈正相關(guān)，與AN、AP和AK呈負(fù)相關(guān)；油壺菌門(mén)與AP呈正相關(guān)，新美鞭菌門(mén)、毛霉門(mén)、球囊菌門(mén)、胡菌門(mén)真菌門(mén)類與各環(huán)境因子均呈負(fù)相關(guān)；絲足蟲(chóng)門(mén)與各環(huán)境因子間呈正相關(guān)；Aphelidiomycota與pH、OM和AN呈正相關(guān)，與AP和AK呈負(fù)相關(guān)。同其它環(huán)境因子相比，當(dāng)AN和AK產(chǎn)生變化時(shí)，真菌群落反應(yīng)較敏感。綜合分析可以得出，除有機(jī)質(zhì)可以影響土壤細(xì)菌群落變化外，堿解氮和速效鉀也是影響土壤微生物群落變化的環(huán)境因子。

表5 土壤微生物相對(duì)豐度與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)（門(mén)水平）Table 5 Correlation coefficient between relative abundance of soil microorganisms and environmental factors（Phylum）

3 討論與結(jié)論

本研究采用第二代高通量16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤樣品中的所有微生物保守區(qū)序列進(jìn)行檢測(cè)，分析土壤中微生物物種的相對(duì)豐度及群落組成［13］，可以更加真實(shí)反映土壤微生物組成情況。結(jié)果表明，苜蓿連作4年后，顯著降低了土壤pH值，緩解了土壤鹽堿化；增加了土壤有機(jī)質(zhì)及堿解氮含量，提高了可供作物吸收的土壤養(yǎng)分；土壤中有效磷含量顯著低于對(duì)照，可能是由于苜蓿生長(zhǎng)過(guò)程中需要大量磷素，種植戶在生產(chǎn)過(guò)程中為了減少成本投入磷肥量較少，導(dǎo)致連作4年后土壤中有效磷含量低于對(duì)照；土壤中速效鉀含量在2個(gè)處理中差異不顯著，說(shuō)明其受苜蓿連作影響較小。同時(shí)，土壤中細(xì)菌和真菌多樣性及相對(duì)豐度有所提高，增強(qiáng)了土壤抵抗逆境的能力。

苜蓿連作后細(xì)菌群落構(gòu)成變化較大。同對(duì)照相比，連作4年后土壤中酸桿菌門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度提高了32.33%，而酸桿菌門(mén)細(xì)菌可以提高纖維素分解能力，部分細(xì)菌甚至可能具有光合作用［14，15］，在分解植物殘?bào)w和碳循環(huán)中起到了重要的作用；放線菌門(mén)相對(duì)豐度提高了94.39%，放線菌門(mén)可以產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物和胞外酶，因此在植物病害的防御方面有重要作用［16］。Mendes等［17］研究發(fā)現(xiàn)，土壤抗病能力同根際土壤中放線菌相對(duì)豐度成正相關(guān)，病害發(fā)生率較低的土壤中，放線菌的數(shù)量總是高于病害發(fā)生率較高的土壤。變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別降低了16.70%和47.17%，Broszat等［18］、井曉歡等［19］和Liu等［20］研究表明，這兩類細(xì)菌在逆境中數(shù)量會(huì)急劇增加。γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱和α-變形菌綱的細(xì)菌則可以降解二甲四氯（MCPA，一種有機(jī)農(nóng)藥），從而使自身占據(jù)菌群優(yōu)勢(shì)。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，上述3個(gè)細(xì)菌綱均有不同程度的降低，說(shuō)明連作苜?？稍谝欢ǔ潭雀纳仆寥拉h(huán)境質(zhì)量。

根據(jù)真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，子囊菌門(mén)所占比例最大，擔(dān)子菌門(mén)次之。子囊菌可以產(chǎn)生大量的無(wú)性孢子，從而快速生長(zhǎng)，這與王艷云等［21］研究結(jié)果相同。有研究認(rèn)為，子囊菌是土壤中重要的真菌分解者，對(duì)降解土壤有機(jī)質(zhì)起著重要的作用［12］；也有研究認(rèn)為，擔(dān)子菌能夠很好地降解木質(zhì)纖維素，其種類豐富，具有食用和藥用價(jià)值，也有一些是有害真菌，會(huì)使作物產(chǎn)生病害。隨種植年限增加，擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸降低，可能與苜蓿周年刈割多次，凋落物較少，未能為擔(dān)子菌提供更適宜的生存環(huán)境有關(guān)；球囊菌門(mén)中部分真菌能夠與植物形成互利共生聯(lián)合體，幫助植物吸收氮、磷等元素，提高植物對(duì)土傳病害和干旱等生物及非生物脅迫的耐受性［22］；油壺菌及傘菌綱相對(duì)豐度同土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮等土壤理化性質(zhì)呈顯著正相關(guān)［23］。

綜合分析表明，種植苜蓿可以降低土壤鹽堿化程度，增加土壤養(yǎng)分，改善土壤生態(tài)環(huán)境，提高土壤抗逆能力。尤其是多年連作后，可以提高土壤微生物多樣性，使有益微生物群落數(shù)量顯著增加，研究結(jié)果為篩選適宜鹽堿地區(qū)生存微生物菌株，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的生物肥料奠定了基礎(chǔ)，也為在華北地區(qū)推廣苜蓿種植提供了理論依據(jù)。