汪生毅， 孫小紅， 王新法

(1.青海省婦女兒童醫(yī)院腦外科， 青海 西寧 810000 2.江蘇省南京市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科， 江蘇 南京 210000)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是指直接或間接暴力造成的腦損傷，TBI患兒還可伴有腦腫脹和進(jìn)行性顱內(nèi)壓升高，具有較高的致死率和致殘率，嚴(yán)重威脅患兒身心健康[1]。探究TBI患兒病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)并分析其臨床價(jià)值對(duì)TBI患兒的診治具有重要意義。微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)是miR-34家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面有很大作用[2,3]。一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的新型生物信使分子，在心腦血管、神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[4]。腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是重要的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在腦部炎癥活動(dòng)及免疫中有重要作用[5]。目前miR-34a、NO、TNF-α在TBI患兒中的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α表達(dá)水平，探討三者聯(lián)合檢測(cè)在TBI中的意義，以期為臨床診治TBI提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年9月至2019年8月青海省婦女兒童醫(yī)院收治的78例TBI患兒為T(mén)BI組，其中男性40例、女性38例，年齡2～14歲，平均年齡(8.36±2.72)歲。根據(jù)GCS評(píng)分[6]將TBI患兒分為輕度組23例(≥11分)，中度組30例(6～10分)，重度組25例(3～5分)。GCS評(píng)分最高分為15分，評(píng)分越低，患兒腦顱損傷越嚴(yán)重。納入標(biāo)準(zhǔn)：①受傷后12h內(nèi)入院接受治療；②入院后經(jīng)CT等影像學(xué)檢查確診為T(mén)BI；③年齡在2歲-14歲之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出現(xiàn)深度昏迷者；②合并惡性腫瘤者；③合并慢性疾病或感染性疾病者；④合并心、肝、腎功能不全者。同時(shí)選取同期體檢健康的兒童80例為對(duì)照組，其中男性41例、女性39例，年齡3～14歲，平均年齡(8.93±3.12)歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)青海省婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，均取得受試兒童的家屬知情同意并簽字。

1.2主要試劑與儀器:miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(北京天根生化有限公司，批號(hào)DP501、KR201、FP401)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)ml077385)；NO測(cè)試盒(化學(xué)法)(南京建成生物工程研究所，批號(hào)A013-1)；無(wú)水乙醇、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(上海生物工程有限公司，批號(hào)SL-0917、SD-1668)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Merin-ton公司，型號(hào)NanoDrop2000)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500Fat)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)MODEL550)。

1.3方 法

1.3.1樣品采集及保存:所有病例均于入院后1h內(nèi)、對(duì)照組于體檢當(dāng)日清晨空腹抽取外周靜脈血5mL，均靜置30min，室溫3000rpm/min，離心15min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清中miR-34a水平:使用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取血清RNA，檢測(cè)其濃度與純度。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，反應(yīng)體系為20μL(0.5g/mL總RNA 1μL，反轉(zhuǎn)錄酶2μL，RNase Free水5μL，2×反轉(zhuǎn)錄緩沖混合物10μL，0.1% BSA 2μL)，反應(yīng)條件為：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min。采用Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒和7500Fat型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)兩組研究對(duì)象血清中miR-155水平進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)體系為20μL(cDNA模板 2μL，2×miRcute miRNA Premix 10μL，正向引物0.4μL，正向引物0.4μL，ddH2O 7.2μL)，引物交由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1，反應(yīng)條件為：94℃ 2min；95℃ 20s，60℃ 34s，45個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析為95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s (收集熒光信號(hào))，60℃ 15min。使用U6為內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)水平RQ=2-△△Ct(△Ct = Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參，△△Ct =△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組)。

表1 引物名稱(chēng)及序列

1.3.3化學(xué)比色法檢測(cè)血清中NO水平:采用化學(xué)比色法檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中NO的水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α水平:采用ELISA法檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中TNF-α的水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4隨訪:對(duì)所有的患兒進(jìn)行復(fù)查或電話隨訪，隨訪時(shí)間為3個(gè)月，末次隨訪時(shí)間截止2019年11月30日，死亡患兒以死亡時(shí)間作為隨訪截止期，無(wú)失訪。觀察記錄患兒隨訪期間生存情況。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組與TBI組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平比較:TBI組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與TBI組患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平比較

2.2不同程度TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平及GCS評(píng)分比較:重度組TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于中度組與輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中度組TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組與TBI組患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平及GCS評(píng)分比較

2.3TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評(píng)分相關(guān)性分析:經(jīng)Pearson法分析得，TBI患兒血清miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 TBI患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平與GCS評(píng)分相關(guān)性

2.4ROC曲線分析血清中miR-34a、NO、TNF-α水平對(duì)TBI的預(yù)測(cè)價(jià)值:ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-34a、NO、TNF-α水平預(yù)測(cè)TBI的曲線下面積分別為0.821(95%CI：0.675～0.967)、0.902(95%CI：0.816～0.989)、0.851(95%CI：0.741～0.961)，截?cái)嘀禐?.65、38.45μmoL/L、153.49pg/mL，敏感度為88.9%、94.4%、72.2%，特異度72.0%、70.0%、98.0%。聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)TBI的曲線下面積為0.998(95%CI：0.992～1.000)，敏感度為100.0%，特異度98.0%。見(jiàn)圖1。

2.5血清中miR-34a、NO、TNF-α水平與TBI患兒3個(gè)月存活率的關(guān)系:死亡組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 血清中miR-34a NO TNF-α水平與TBI患兒3個(gè)月存活率的關(guān)系

圖1 ROC曲線分析血清中miR-34a、NO、TNF-α水平對(duì)TBI的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

TBI可對(duì)患兒腦神經(jīng)功能造成不同程度的損害，其主要臨床癥狀為頭痛、嘔吐、凝血功能障礙、意識(shí)障礙、瞳孔散大、生命體征紊亂等，嚴(yán)重影響了患兒的身心健康及生活質(zhì)量[7]。重度TBI患兒死亡率高、預(yù)后差，對(duì)機(jī)體多臟器功能均有一定的影響，尋找監(jiān)測(cè)TBI的病情進(jìn)展及預(yù)后的生物指標(biāo)是十分有必要的[8]。MicroRNA參與多種疾病的發(fā)生，可作為診斷多種心、腦疾病的重要標(biāo)志物[9]。Tolosa[10]等研究發(fā)現(xiàn)，在使用體內(nèi)或體外方法實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)TBI后，miR-34a上調(diào)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示TBI組患兒血清中miR-34a水平高于對(duì)照組，重度組TBI患兒血清中miR-34a水平高于中度組與輕度組，中度組TBI患兒血清中miR-34a水平高于輕度組，提示miR-34a在TBI患兒血清中呈高表達(dá)，可能與TBI的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

NO能介導(dǎo)炎性反應(yīng)進(jìn)而加重細(xì)胞損傷，在正常水平下可引起血管擴(kuò)張，促進(jìn)血液循環(huán)，但其水平過(guò)高卻會(huì)加重對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒害作用[11]。呂學(xué)文[12]等研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NO水平在輕度組、中度組及重度組創(chuàng)傷性TBI患者血清中依次升高。本研究結(jié)果顯示，TBI組患兒血清NO水平高于對(duì)照組，重度組患兒血清中NO水平高于中度組與輕度組，中度組患兒血清中NO水平高于輕度組，提示NO水平與TBI嚴(yán)重程度密切相關(guān)，與呂學(xué)文等研究結(jié)果一致。TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α水平升高與TBI程度及預(yù)后有關(guān)[13,14]。王娜[15]等研究發(fā)現(xiàn)，TBI患者TNF-α水平均高于對(duì)照組，且中、重度組患者TNF-α水平均高于輕度組，重度組患者TNF-α水平均高于中度組。本研究結(jié)果顯示，TBI組患兒血清中TNF-α水平高于對(duì)照組，且TNF-α水平在輕度組、中度組、重度組TBI組患兒血清中依次升高，提示TNF-α可能與TBI的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TBI患兒血清miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，提示miR-34a、NO、TNF-α水平與TBI患兒的病情程度有明顯相關(guān)性，三者可能存在協(xié)同作用參與TBI病程中，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。ROC分析顯示，miR-34a、NO、TNF-α均能較好的預(yù)測(cè)TBI患兒，聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)效能更高，提示三者可能作為臨床預(yù)測(cè)TBI的生物指標(biāo)。另外本研究結(jié)果顯示死亡組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平明顯高于存活組，提示miR-34a、NO、TNF-α水平有助于評(píng)估TBI患兒不良預(yù)后，可作為反映TBI患兒不良預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，miR-34a、NO、TNF-α在TBI患兒血清中均呈高表達(dá)水平，與TBI程度密切相關(guān)，具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，可作為反映TBI患兒不良預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。但是由于樣本數(shù)量不多，尚有不足之處，今后將重視擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行深入研究。