季一峰，鮑超，李彥彩，陳棟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

缺血缺氧性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是腦組織缺血缺氧引起的腦部病變，其中新生兒HIE最為常見[1]。HIE分為輕、中、重三種程度，臨床表現(xiàn)上，輕度常出現(xiàn)興奮癥狀，中度以抑制癥狀為主，重度則可至昏迷。研究表明[2]，我國(guó)HIE發(fā)病率可達(dá)活產(chǎn)新生兒的3‰～6‰，其中死亡于新生兒期的患兒約占15%～20%。存活的患兒亦有20%～30%留下神經(jīng)系統(tǒng)損傷，如腦癱、癲癇、智力障礙、感覺障礙或?qū)W習(xí)障礙[3-4]，給本人、家庭與社會(huì)都造成沉重的負(fù)擔(dān)。

HIE至今尚無完整統(tǒng)一的治療方案，治療上主要以糾正缺血缺氧為主。亞低溫治療是目前公認(rèn)治療新生兒腦病有效的療法，但是其安全性仍未明確[5]，甚至存在著硬腫及彌散性血管內(nèi)凝血的風(fēng)險(xiǎn)[6]。針刺治療HIE已被證實(shí)確有療效[7]，然而，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。目前許多研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exo)能夠減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，達(dá)到腦保護(hù)作用[8]。基于此，本文分析了MSC-Exo及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與HIE的關(guān)系，探討了MSC-Exo在針刺治療HIE中的可能作用。

1 細(xì)胞凋亡與HIE的相關(guān)性

1.1 細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致HIE的重要因素

HIE的病因是由各種原因所致的腦組織缺血缺氧，其中圍產(chǎn)期窒息是最主要的原因[9]。HIE的發(fā)病機(jī)制尚未明晰，一般認(rèn)為可能與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫功能改變有關(guān)[10]，最終引起腦水腫、神經(jīng)膠質(zhì)增生、神經(jīng)元壞死等腦組織病理性損害[11]。其中，細(xì)胞凋亡在HIE的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞為了保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在基因調(diào)控下有序、自主地死亡。細(xì)胞凋亡對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用[12]。細(xì)胞內(nèi)外的各種病理因素，都可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

1.2 缺血缺氧下細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制

缺血缺氧環(huán)境下，腦組織血流量下降，供氧不足，會(huì)增快神經(jīng)元細(xì)胞能量消耗，加劇興奮性毒性與氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激加劇則會(huì)引起線粒體功能衰退，進(jìn)一步增快神經(jīng)元細(xì)胞的能量消耗，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷乃至凋亡。氧化應(yīng)激加劇還會(huì)使線粒體膜內(nèi)外離子通透性增加，使線粒體跨膜電位改變，從而引起鈣離子超載，增加細(xì)胞負(fù)荷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷與凋亡。此外，細(xì)胞凋亡又會(huì)反過來進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激，造成惡性循環(huán)，加重缺血缺氧的進(jìn)展，對(duì)腦組織造成持續(xù)性損傷[13-14]。

因此，通過干預(yù)減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生與進(jìn)展，是治療HIE的一條關(guān)鍵途徑。

2 MSC分泌抗細(xì)胞凋亡的外泌體，治療HIE

2.1 MSC分泌攜帶miRNAs的外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種多能干細(xì)胞，有著自我更新與多向分化的能力，是目前生命科學(xué)的新熱點(diǎn)。MSC能夠分泌細(xì)胞外囊泡，將生物活性分子輸送至靶細(xì)胞，從而修復(fù)受損組織[15]。細(xì)胞外囊泡分為外泌體、凋亡小體和微泡，研究最為廣泛的是外泌體。外泌體是一類直徑在40～100 nm的脂質(zhì)囊泡[16]，其內(nèi)容物中包裹各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNAs[17]，通過將這些物質(zhì)靶向釋放，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間物質(zhì)傳遞的作用。諸多研究證明，外泌體能夠減輕缺血缺氧下的細(xì)胞損傷與凋亡[18-20]，這可能與外泌體內(nèi)容物中的miRNAs有關(guān)。

2.2 miRNAs調(diào)控細(xì)胞凋亡

miRNAs是一類由核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA分子，在細(xì)胞增長(zhǎng)、分化以及凋亡等方面發(fā)揮巨大作用[21]。越來越多研究證明，miRNAs能夠通過調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而干預(yù)HIE。XIAO Q X等人[22]發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)大鼠的miR-410-3p水平明顯低于正常大鼠。在上調(diào)miR-410-3p水平后，HIBD大鼠的神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低，神經(jīng)元存活數(shù)量增加，運(yùn)動(dòng)與認(rèn)知能力也有所提升。YANG G等人[23]發(fā)現(xiàn)，在HIE模型中miR-146b-5p的過表達(dá)能減輕細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)，而抑制miR-146b-5p則具有相反的作用。miR-21亦是一個(gè)重要的抗凋亡miRNA，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PTEN水平，激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，改善腦損傷[24-25]。

由此可見，MSC來源的miRNAs能靶向作用于神經(jīng)元細(xì)胞，介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，達(dá)到腦保護(hù)作用。

2.3 MSC的臨床運(yùn)用現(xiàn)狀與問題

綜上，越來越多的人們開始考慮運(yùn)用MSC治療HIE。MSC移植是目前臨床上的一種前沿療法。DING H等人[26]將胎盤來源的MSC移植入HIBD模型大鼠后，發(fā)現(xiàn)抗炎因子白細(xì)胞介素-10水平增加，炎性反應(yīng)減輕，提示MSC可能通過釋放抗炎因子從而改善腦損傷。JOERGER-MESSERLI M S等人[27]發(fā)現(xiàn)，MSC移植能夠減輕圍產(chǎn)期HIE小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，而這種作用似乎是由MSC分泌的let-7-5p調(diào)控所致的。

雖然MSC在抗凋亡方面有效，但在臨床實(shí)踐中也存在著一定的局限性。一方面，目前MSC在體外實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)細(xì)胞存活率較低，移植難度較大，價(jià)格相對(duì)較貴等問題，制約著現(xiàn)階段臨床推廣運(yùn)用使用。另一方面，對(duì)于MSC移植治療，我國(guó)尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程，在安全性、有效性及穩(wěn)定性方面仍需進(jìn)一步完善。因此，如何更有效、更低廉、更規(guī)范化地將MSC運(yùn)用于HIE的治療中，是當(dāng)前亟需解決的一個(gè)難題。

3 針刺調(diào)控MSC治療HIE的可能機(jī)制

3.1 中醫(yī)學(xué)對(duì)HIE的認(rèn)識(shí)

HIE在中醫(yī)學(xué)中無明確病名，依照臨床表現(xiàn)，可歸為“五遲”“五軟”“胎弱”“胎怯”范疇。本病病位在腦，其基本病機(jī)是腦髓不充，肢體失用。病因方面，則可歸為先天稟賦不足或是后天調(diào)養(yǎng)失當(dāng)[28]。一方面，父母精血不足，或母親孕期中疾病纏身，或早產(chǎn)者，致患兒先天稟賦不足，致使精血不足，腦髓不充，筋骨肌肉、四肢百骸皆失所養(yǎng)。正如《醫(yī)宗金鑒·幼科心法要訣》所云：“小兒五遲之癥，多因父母氣血虛弱，先天有虧”。另一方面，亦有后天感受邪毒，或難產(chǎn)、產(chǎn)傷，或臍繞頸等者，損傷腦絡(luò)，以致腦髓不充，導(dǎo)致四肢百骸、筋骨肌肉失養(yǎng)，發(fā)為本病?！墩\(chéng)書·論行遲》云：“又有離胎多病，與飲病乳，或過食肥甘，則疳癥所侵，血?dú)馊諔v，十有六七”。因此治療上，當(dāng)立足病因病機(jī)，以健腦生髓為根本大法。

3.2 針刺治療HIE機(jī)制仍需探究

針刺療法在治療HIE方面已被臨床證實(shí)確有療效，前景十分廣闊?！端貑枴す强照摗吩疲骸岸矫}者……貫脊屬腎……與太陽起于目?jī)?nèi)眥，上額交巔，上入絡(luò)腦”。督脈是“陽脈之?！?，總督一身之陽，又貫脊背而入腦。與足太陽膀胱經(jīng)相交，有著溫陽行氣，補(bǔ)腦生髓之效，故許多醫(yī)家都非常注重督脈的運(yùn)用。此外，《素問·陰陽應(yīng)象大論》認(rèn)為“腎生骨髓”，因此在治療上亦當(dāng)注重補(bǔ)腎生髓。趙梁育[29]等通過針刺督脈、任脈、膀胱經(jīng)諸穴，并聯(lián)合丹參注射液治療HIE，有效率達(dá)89.47%，治療后患兒血流變、新生兒神經(jīng)行為評(píng)分表(NBNA)均有顯著提高。張生玉[30]等采用“醒腦開竅”針法，針刺“四神聰”“百會(huì)”“水溝”“風(fēng)池”“內(nèi)關(guān)”“太沖”等穴，并結(jié)合高壓氧治療HIE，發(fā)現(xiàn)患兒血流變、認(rèn)知功能與日常生活行為能力均優(yōu)于單純高壓氧治療。

雖然目前很多研究證明了針刺對(duì)于治療HIE有效，但是作用機(jī)制尚有爭(zhēng)議。目前關(guān)于針刺治療HIE作用機(jī)制的研究是多方面的，涉及腦血流量、病理形態(tài)學(xué)、能量代謝、自由基代謝、細(xì)胞凋亡、突觸聯(lián)系、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)等，但許多機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

3.3 針刺調(diào)控miRNAs抑制細(xì)胞凋亡

越來越多的研究證明，針刺能夠調(diào)控miRNAs水平，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。ZHOU H[31]等人用電針(Electro-acupunture，EA)刺激大腦中動(dòng)脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，發(fā)現(xiàn)EA能夠抑制miR-191a-5p的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織。SHA R[32]等人發(fā)現(xiàn)EA刺激MCAO模型大鼠后，大鼠miR-223的水平升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，這說明EA可能通過調(diào)控miR-223水平減少細(xì)胞凋亡，從而治療腦損傷。 ZHANG S[33]等人發(fā)現(xiàn)EA可以上調(diào)miR-146b的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，從而改善MCAO大鼠的神經(jīng)損傷。

由此可見，miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是針刺治療HIE的作用機(jī)制，但起作用的miRNAs的來源仍需進(jìn)一步探究。

3.4 針刺調(diào)控MSC水平

MSC-Exo能夠定向遷移至靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞，從而治療疾病。這與中醫(yī)學(xué)中的經(jīng)絡(luò)相類似。經(jīng)絡(luò)“溝通表里，聯(lián)系臟腑”，又“運(yùn)行氣血，調(diào)和陰陽”，亦是一個(gè)進(jìn)行物質(zhì)傳遞，從而治療疾病的通道。因此，MSC-Exo很有可能是經(jīng)絡(luò)的科學(xué)內(nèi)涵之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，針刺會(huì)通過經(jīng)絡(luò)產(chǎn)生治療作用。從分子生物學(xué)角度上來看，很可能是針刺作用于MSC，通過MSC-Exo將攜帶的miRNAs釋放于靶細(xì)胞，從而產(chǎn)生治療作用。

如果受到針刺調(diào)控的miRNAs來源于MSC，那么針刺應(yīng)當(dāng)對(duì)MSC產(chǎn)生作用。最新研究表明，針刺確實(shí)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)MSC的水平。

LIU L[34]等人用電針(EA)刺激大鼠“脊中”“命門”穴位，發(fā)現(xiàn)外周血中的MSC水平顯著增高，由此提出，EA刺激能夠促進(jìn)骨髓MSC進(jìn)入外周血循環(huán)。SALAZAR T E[35]等人則通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確作用機(jī)理。研究指出，在經(jīng)過EA刺激后，大鼠外周血內(nèi)的MSC水平明顯高于刺激前，這可能是由于EA使得大鼠下丘腦內(nèi)以及下丘腦與杏仁核等鄰近腦區(qū)之間的功能連接強(qiáng)度增加，從而激活交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)所致，激活的SNS促進(jìn)MSC釋放到外周血循環(huán)中，增加循環(huán)MSC水平并轉(zhuǎn)運(yùn)到受損組織，從而輔助組織修復(fù)。

由此可見，在針刺作用下，MSC的水平提高。MSC水平提高則會(huì)產(chǎn)生更多的MSC-Exo作用于靶細(xì)胞，使得miRNAs表達(dá)增加，從而抑制細(xì)胞凋亡，形成腦保護(hù)作用。這可能是針刺治療HIE的分子生物學(xué)機(jī)制之一。

4 小結(jié)

目前，關(guān)于針刺通過調(diào)節(jié)MSC-Exo從而治療HIE的研究鮮有報(bào)道。但是目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床的MSC移植治療方案，證明了MSC-Exo攜帶著miRNAs等物質(zhì)，通過多種通路靶向作用于神經(jīng)元細(xì)胞，從而介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，達(dá)到腦保護(hù)作用。而最新研究表明，針刺能夠調(diào)控miRNAs介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，亦能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的MSC?；诖耍P者推測(cè)針刺能夠通過對(duì)自體MSC的調(diào)節(jié)，促進(jìn)MSC-Exo源性miRNAs的釋放于靶細(xì)胞，從而減輕細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療HIE的效果。在今后的研究中，深入探究MSC、MSC-Exo以及miRNAs在治療HIE中的作用，能夠?yàn)獒槾讨委烪IE提供科學(xué)客觀的作用機(jī)制，帶來新的研究思路與研究途徑，從而更好地服務(wù)于臨床。