康伊，張偉，孫蔚雯，王晶，張艷，逯春鵬

Wnt信號在生物體發(fā)育過程中的作用至關(guān)重要，同時也在多種病理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用（如神經(jīng)退行性變、骨質(zhì)疏松和癌癥）。諸多研究表明，Wnt信號在心臟重構(gòu)和心力衰竭（心衰，HF）等病理過程中被顯著激活。本文主要介紹Wnt信號通路及其調(diào)控機制，總結(jié)Wnt信號通路參與心肌肥大的病理過程。在此基礎(chǔ)上，前瞻性地介紹利用降解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)和溶酶體降解技術(shù)的基本原理，探討將靶向降解技術(shù)用于調(diào)控Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的治療心力衰竭（心衰）等心臟相關(guān)疾病的前景。

心衰是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一組臨床綜合征，是各種心臟疾病的嚴重和終末階段，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，液體潴留，組織灌注減少，致死性心律失?；虮貌蛔愕痊F(xiàn)象[1]。其發(fā)病率高，有臨床癥狀患者的5年存活率與惡性腫瘤相仿。據(jù)國外統(tǒng)計，人群中心衰患病率約1.5%～2.0%，且過去40年中，心衰導(dǎo)致的死亡增加了6倍。我國對35～74歲居民抽樣調(diào)查中發(fā)現(xiàn)慢性心衰患病率為0.9%，慢性心衰患者約有400萬人，已成為21世紀我國心血管病領(lǐng)域的突出問題[2]。

Wnt基因是從小鼠乳腺癌中克隆的一種原癌基因，是由脂質(zhì)修飾的糖蛋白。目前，已在人類中分離、鑒定了19種Wnt配體。Wnt配體分為兩類，即Wnt1類和Wnt5a類。Wnt1類激活Wnt經(jīng)典信號通路，包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8及 Wnt8a；Wnt5a類激活非經(jīng)典信號通路，包括Wnt 4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11[3]。參與Wnt信號通路的受體蛋白包括Frizzled（Fzd）受體、LRP5/6受體及下游信號分子糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、β-catenin、散亂蛋白Disheveled（Dsh）、T細胞因子/淋巴樣增強因子（Tcf/Lef）、細胞支架軸蛋白（Axin）等[4]。

1 Wnt信號通路的基本情況

Wnt/Fzd受體復(fù)合物能激活多種信號通路，主要分經(jīng)典Wnt信號通路、平面極性（PCP）信號通路和Ca2+信號通路[5]。目前研究最清楚的途徑是β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號，其中β-catenin作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使。在靜息狀態(tài)下，β-catenin被一種 “降解復(fù)合物”的蛋白質(zhì)復(fù)合物磷酸化，進而被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而維持細胞內(nèi)Wnt信號通路處于未激活狀態(tài)。哺乳動物的Wnt信號通路降解復(fù)合體是由APC蛋白，Axin，CK1和GSK3β共同組成的。當(dāng)細胞外的Wnt蛋白配體與細胞膜受體Fzd、LPRP5/6結(jié)合時，細胞內(nèi)的Dishevelled蛋白就會被募集到細胞膜，進而將降解復(fù)合物募集到細胞膜附近并將其打散。這導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的β-catenin蛋白擺脫了被降解的命運，在細胞質(zhì)內(nèi)大量積累，并依靠自身攜帶的入核信號轉(zhuǎn)位進入細胞核，入核后β-catenin蛋白與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，介導(dǎo)了一系列經(jīng)典Wnt信號通路的靶基因表達[6]。

除β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號通路外，Wnt蛋白配體還可激活PCP信號通路和Ca2+信號通路。PCP通路主要控制細胞相對于鄰近細胞的方向。非經(jīng)典Wnt信號配體結(jié)合Fzd和ROR2/RYK等輔助受體后，招募Dsh蛋白富集到細胞膜，進而激活兩種小GTP激酶：Rho和Rac，而Rac-GTP酶進一步激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK），發(fā)揮調(diào)控微管蛋白等細胞骨架的作用。Wnt/Ca2+信號通路通過Wnt5a和Wnt11激活G蛋白激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC），引起細胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分激活，以調(diào)節(jié)細胞運動和細胞黏附性，此通路能拮抗經(jīng)典的Wnt信號通路[7,8]。

2 Wnt 信號通路參與心力衰竭

心肌肥大是心臟的一種代償反應(yīng)，主要特征是心肌細胞體積增大。心肌細胞是終末分化的細胞，當(dāng)心臟面臨負荷增加或損傷時，它們的增殖率就會不足[9]。因此，心肌細胞對這些挑戰(zhàn)的反應(yīng)主要是肥大生長。心肌細胞肥大可以源于生理刺激反應(yīng)（如運動或懷孕），也可能源于病理刺激（如高血壓或瓣膜缺陷）。容量過載（如瓣膜缺陷引起）會導(dǎo)致偏心性或外向性肥厚，而主動脈狹窄或高血壓引起的壓力過載會導(dǎo)致向心性或內(nèi)向性肥厚。當(dāng)向心性肥厚的根本原因得不到治療時，就會演變成偏心性重構(gòu)，通常稱為擴張型心肌病[10]。

研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在心肌肥大中起到重要作用。Malekar等[11]實驗表明，經(jīng)典Wnt信號通路在Dsh過表達轉(zhuǎn)基因小鼠中激活，Dsh過表達小鼠出生3個月后出現(xiàn)嚴重的心肌肥大表型，心肌細胞體積明顯比正常小鼠增大且過早死亡；相反，在Dsh敲除的心肌細胞中β-腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)受到抑制。在壓力超負荷下，抑制GSK3β的絲氨酸9位點磷酸化降低了小鼠心肌肥大和心衰的發(fā)生率[12]。β-catenin敲除的雜合成年小鼠心臟重量和心臟重量與體重比，均低于β-catenin基因完整組小鼠，表明細胞質(zhì)中β-catenin促進肥大反應(yīng)[13]。研究還表明，非經(jīng)典Wnt通路也與心肌肥大有關(guān)。JNK在心肌肥大中起重要作用，MKK7D轉(zhuǎn)基因小鼠心臟左右心房均變大，而MKK7D表達顯著激活JNK表達[14]，Dsh過表達的心肌肥大小鼠體內(nèi)Wnt/PCP信號通路和Wnt/Ca2+信號通路均被激活[11]。

許多心血管疾病均會導(dǎo)致心衰，心衰是各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種綜合征，是多種心血管疾病的最終病理變化。在幾項針對人類心衰的研究中，觀察到了與sFRPs蛋白水平升高的聯(lián)系。在衰竭的人類心臟中觀察到sFRP3和sFRP4的mRNA水平增加，而不是sFRP1和sFRP2，且與β-catenin水平降低有關(guān)[15]。最近Askevold等證實了sFRP3表達的增加，他們還報告了心衰患者血清中sFRP3水平的增加與心血管死亡率相關(guān)[16]。這些觀察結(jié)果表明，內(nèi)源性Wnt拮抗劑的表達抑制了心衰時的Wnt信號傳導(dǎo)。

必須注意的是，在142例心衰患者的1年隨訪中，sFRP3水平與心血管事件發(fā)生之間的相關(guān)性并未達到統(tǒng)計學(xué)意義[17]。相比之下，Hou等最近發(fā)表了關(guān)于人類和小鼠衰竭心臟中經(jīng)典Wnt信號激活的證據(jù)。在這項研究中，β-catenin的核積累和轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2的激活導(dǎo)致c-Myc的表達增加—心臟應(yīng)激期間表達的Wnt靶基因[18]。Dapper1（Dpr1）是核質(zhì)穿梭蛋白在細胞核內(nèi)抑制Wnt信號，上調(diào)的Dpr1作用于上游Dsh2激活經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)心肌重構(gòu)，使小鼠左室收縮和舒張功能受損[19]，Haq等研究表明，心衰患者心臟中GSK3β被抑制[20]。此外，心臟特異性過表達Dsh的小鼠中經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路均被激活，Dsh過表達引起小鼠心肌肥大、心衰和過早死亡[11]。以上研究表明，Wnt信號通路在心衰過程中還存在相互矛盾的研究結(jié)果，需要更多更精確的體內(nèi)研究來進一步研究論證。

3 靶向降解技術(shù)

諸多人類遺傳學(xué)研究表明，許多新的靶蛋白通過獲得功能性毒性而引起疾病。傳統(tǒng)的藥物開發(fā)策略需要占據(jù)結(jié)合位點進而抑制目標蛋白功能活性，這使得支架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和其他非酶蛋白等與疾病相關(guān)的蛋白靶點都變得“不可成藥”。通過人工調(diào)控泛素—蛋白酶體系統(tǒng)和自噬—溶酶體系統(tǒng)，可通過細胞內(nèi)的質(zhì)量控制系統(tǒng)糾正或降解“不可成藥”的致病蛋白質(zhì)[21]。目前，通過靶向降解技術(shù)調(diào)控Wnt信號通路的活性，已經(jīng)取得了部分突破性研究進展。

3.1 PROTAC降解技術(shù)目前小分子誘導(dǎo)蛋白降解的主要方法是降解靶向嵌合體技術(shù)（PROTAC）。PROTAC分子通過拉近靶蛋白和E3連接酶的距離從而提高靶蛋白的泛素化效率，進而誘導(dǎo)蛋白酶體系統(tǒng)對靶蛋白進行降解。但同時，PROTAC技術(shù)存在一定局限性，比如該方法依賴特定E3連接酶，限制其在某些細胞中的應(yīng)用；其分子量普遍偏大，成藥性存在一定問題等[21]。

2001年，Crews和同事為PROTAC技術(shù)提供了概念性證據(jù)。他們合成了一個名為Protac-1的嵌合大分子，將MetAP-2招募到Skp1-Cullin-Fbox復(fù)合物，以劑量依賴性方式導(dǎo)致MetAP-2蛋白泛素化和降解[22]。然而，MetAP-2共價結(jié)合部分是一個肽，阻礙了嵌合大分子進一步的應(yīng)用，因為它的大分子尺寸導(dǎo)致細胞滲透性差。2015年，Brader研究團隊又建立了一個重要的基于cereblon蛋白（CRBN）的PROTAC系統(tǒng)[23]。另一個PROTAC系統(tǒng)，基于HIF1-α介導(dǎo)的VHLPROTAC系統(tǒng)肽，最初于2004年引入[24]。2015年，通過羥脯氨酸樣小分子替代VHL靶向肽，使得VHL-PROTAC系統(tǒng)的親和性和特異性顯著提高，極大地擴展了其應(yīng)用[25]。目前雖有大于600個已知的人類E3連接酶，但已建立的依賴E3連接酶PROTAC系統(tǒng)不到10個，應(yīng)用最廣泛的有CRBN[26]、VHL[25]、cIAP[27]和MDM2[28]。

3.2 溶酶體降解技術(shù)除了泛素-蛋白酶體途徑外，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解還可以通過自噬-溶酶體途徑。利用溶酶體降解途徑降解“不可成藥”的蛋白質(zhì)靶點也具有廣泛的開發(fā)前景。溶酶體降解途徑包括內(nèi)體/溶酶體途徑和細胞自噬途徑。細胞自噬途徑始于被稱為自噬體的分離膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)來自具有脂質(zhì)化LC3蛋白的脂質(zhì)雙層膜，自噬體通過膨脹進而吞噬蛋白質(zhì)和其他生物分子，甚至包括細胞器等細胞內(nèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)被隔離在閉合的雙膜囊泡中，隨后被降解[21]。

自噬靶向嵌合體（AUTAC）采用與PROTAC類似的設(shè)計，很適合降解胞質(zhì)中對PROTAC分子具有抗性的目標蛋白。貨物蛋白首先被吞噬形成自噬體，然后SQSTM1/p62等自噬受體識別Lys63（K63）多聚泛素化貨物蛋白，并將它們轉(zhuǎn)移到自噬體進行降解。AUTAC和PROTAC分子均通過泛素化起作用，但AUTAC分子通過觸發(fā)K63多聚泛素化從而誘導(dǎo)靶標降解。研究發(fā)現(xiàn)AUTAC分子具備降解目標蛋白以及受損的線粒體等細胞器的能力[29]。

自噬體偶聯(lián)化合物（ATTEC）則是利用自噬降解目標蛋白的一種更直接方法。ATTEC分子與PROTAC和AUTAC分子不同，不依賴底物的泛素化。ATTEC分子直接將目標蛋白和自噬體關(guān)鍵受體LC3結(jié)合在一起，促進目標蛋白被自噬體吞噬。研究表明，自噬體偶聯(lián)化合物可以在細胞或者動物模型體內(nèi)降解具有重復(fù)擴展的多聚谷氨酰胺（polyQ）的mHTT（突變的亨廷頓蛋白），并減弱HD相關(guān)的表型。ATTEC分子可以和polyQ特異性相互作用從而選擇性降解mHTT且不影響野生型HTT水平。ATTEC分子還能夠降解其他引起疾病的polyQ蛋白。通過直接與自噬體蛋白LC3相互作用并繞過泛素化過程，ATTEC分子在降解DNA/RNA分子、受損的細胞器等通過自噬識別的非蛋白貨物方面具有巨大潛力，但ATTEC分子是否會影響整體自噬活性還有待研究[30,31]。

4 靶向降解技術(shù)調(diào)控Wnt信號通路用于治療心衰

利用靶向降解技術(shù)精確地調(diào)控Wnt信號通路活性，進而用于治療心衰等心臟疾病，已經(jīng)顯示出了初步的前景。陳曄光院士研究組利用PROTAC技術(shù)，成功合成了基于與β-catenin結(jié)合的Axin衍生肽，發(fā)現(xiàn)兩種訂書釘肽SAHPA1和xStAx分別增強或削弱Wnt/β-catenin信號，通過將SAHPA1或xStAx與VHL配體偶聯(lián)來設(shè)計PROTACs，以實現(xiàn)高效的β-catenin蛋白降解。所獲得的xStAx-vhl可在體內(nèi)維持β-catenin的降解，并且對癌細胞和APC-/-類器官中的Wnt信號具有強烈的抑制作用。更重要的是，xStAx-vhl可潛在抑制結(jié)直腸癌患者來源的類器官存活。結(jié)果表明，xStAxvhl突出了β-catenin降解物PROTACs作為一類新型抗癌藥物的潛力[32]。對于xStAx-vhl通過降解β-catenin蛋白下調(diào)Wnt信號通路的活性，在治療或延緩心肌肥大的過程是否具有重要作用，需進一步研究。同時，利用兩種特異性的小肽分子還可更加精細地研究經(jīng)典Wnt信號通路在體內(nèi)心衰程中的詳細機制。

除β-catenin外，Wnt信號通路中還有其他重要蛋白通過靶向降解技術(shù)進行調(diào)控。Dsh蛋白可同時調(diào)控經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路，研究表明，Dsh蛋白可通過細胞自噬途徑進行降解，且Dsh蛋白的聚集化對于調(diào)控Wnt信號功能和自身質(zhì)量控制十分關(guān)鍵[33]。能否通過設(shè)計自噬體偶聯(lián)化合物（ATTEC），實現(xiàn)在體內(nèi)降解調(diào)控Dsh蛋白，精確調(diào)節(jié)Wnt信號通路，從而治療心肌肥大、心衰及心肌梗死后的創(chuàng)傷愈合等病理過程，有待深入研究。此外，Axin蛋白作為β-catenin蛋白降解復(fù)合物的關(guān)鍵蛋白，既可通過泛素—蛋白酶體途徑降解，也可通過自噬—溶酶體途徑降解，通過設(shè)計特定的PROTAC或者ATTEC小分子化合物，也能實現(xiàn)精確調(diào)控Wnt信號通路的功能。

綜上所述，Wnt信號通路在心肌肥大、心肌梗死后傷口愈合等病理過程中的作用，研究十分明確，而在心衰病理過程中的作用仍需進一步研究闡明，靶向蛋白降解技術(shù)作為精確調(diào)控Wnt信號通路的有效手段，未來在治療心衰等心臟相關(guān)疾病中必將大有作為。