趙靜，趙穎，李晗

心力衰竭（心衰，HF）是心臟終末期的疾病，促進(jìn)血管生成可恢復(fù)心肌組織細(xì)胞新生，減少凋亡和纖維化[1,2]。Ⅲ型組蛋白去乙?；福⊿irtuins3，SIRT3）是線粒體功能和細(xì)胞代謝的新型調(diào)節(jié)劑，SIRT3通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）促進(jìn)梗死后的心肌組織中的血管新生[3]。大蒜素是一種來源于大蒜的含硫化合物，其生物學(xué)活性包括調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、抑制炎性反應(yīng)以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激抗纖維化[4]。大蒜素可通過促進(jìn)PPARγ緩解胰島素抵抗[5]。臨床研究顯示大蒜中活性物質(zhì)可以抑制同型半胱氨酸的水平并調(diào)節(jié)脂代謝，從而降低冠心病的發(fā)生風(fēng)險[6]。最新一項(xiàng)細(xì)胞研究結(jié)果顯示大蒜素具有緩解HF的作用[7]。本文主要分析大蒜素對HF大鼠血管再生和心功能的影響，分析其作用是否與SIRT3/PPARγ通路有關(guān)。

1 主要材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，12周，220～250 g）。彩色多普勒超聲診斷儀（型號：SmwScape-S2H，深圳開立公司，中國）。HE、Masson和TUNEL染色試劑盒購自武漢華美公司（中國）。顯微鏡（Olympus公司，日本）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）。組織勻漿機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）。TRIzol（Sigma公司，美國）。RNAspin Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）。Bestar qPCR RT和Bestar?qPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）。Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（Santa公司，美國）。一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1：1000稀釋，#ab6721）（Abcam公司，美國）。硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）。ECL 顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）。

1.2 分組、建模和干預(yù)HF大鼠模型根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]方法結(jié)扎腹主動脈構(gòu)建，大鼠麻醉后切開腹膜并游離主動脈，利用4號手術(shù)線將8號針頭和主動脈共同扎在一起（此步驟為避免結(jié)扎過緊），輕退針頭，縫合傷口并行抗菌處理。8周后通過檢測心功能判斷建模結(jié)果。本研究死亡2只，建模成功49只，成功率81.67%。將45只HF大鼠隨機(jī)分為HF組、HF+低劑量大蒜素組和HF+高劑量大蒜素組（n=15）。同期健康的、僅暴露主動脈不結(jié)扎的大鼠15只作為對照組。大蒜素的灌胃劑量分別為15 mg/kg·d和30 mg/kg·d[9]，連續(xù)21 d。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

1.3.1 心功能檢測二維超聲引導(dǎo)下的M型超聲檢測射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。

1.3.2 HE染色大鼠心肌組織經(jīng)固定、脫水、包埋后切成5 μm的切片，室溫下放入蘇木精中染色10 min。自來水洗滌1～2 min后反藍(lán)，再次用自來水清洗1～2 min后，將玻片放入曙紅中10 s，中性膠密封玻片，在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.3 Masson染色通過Masson染色檢測纖維化情況。將1.3.2中的切片標(biāo)本加入Masson三色染料進(jìn)行染色，利用圖IPP 6.0像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)（CVF）。

1.3.4 TUENL染色將切片標(biāo)本置于45℃的烘箱中過夜。經(jīng)過脫蠟和修復(fù)抗原后，加入蛋白酶K稀釋液在37℃下孵育20 min。洗滌后加入TUNEL試劑在37℃下孵育60 min。PBS洗滌3次，5 min/次。干燥后，加入在熒光衰減劑并在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算凋亡指數(shù)=TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)目×100%）

1.3.5 免疫組化染色通過免疫組化染色檢測血管標(biāo)志蛋白CD31的水平評估心肌組織中血管新生情況。將1.3.2中的切片標(biāo)本在室溫下用3%過氧化氫的甲醇溶液處理30 min，加入CD31的抗體（1：500稀釋）一起孵育過夜，而后加入山羊抗兔IgG二抗（1：1000稀釋）在室溫下孵育2 h。用DAB處理樣本，在×400倍視野下計(jì)算隨機(jī)5個視野中血管數(shù)目。

1.3.6 RT-qPCR使用RNAspin Mini試劑盒從心肌組織中提取RNA，使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。使用Bestar?qPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95℃/2 min， 94℃/20 s，58℃/20 s，72℃/20 s，40個循環(huán)，72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.7 Western blot將心肌組織在放射免疫沉淀測定裂解緩沖液中在冰上裂解。通過8%的SDSPAGE分離每個樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉后將膜與一抗體在4℃下孵育過夜，將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算蛋白相對于GAPDH的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對HF大鼠心功能的影響HF組的EF顯著低于對照組，而LVEDD和LVESD顯著高于對照組（P＜0.05）。HF+高劑量大蒜素組的EF顯著高于HF+低劑量大蒜素組，且兩組均顯著高于HF組（P＜0.05）。HF+高劑量大蒜素組的LVEDD和LVESD顯著低于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05），且二者均顯著低于HF組（P＜0.05），表1。

表1 大蒜素對HF大鼠心功能的影響

2.2 大蒜素對HF大鼠心肌組織損傷的影響HF組大鼠心肌細(xì)胞染色不均勻，排列紊亂；HF+低劑量大蒜素組和HF+高劑量大蒜素組的心肌損傷情況較HF組有明顯的緩解，且HF+高劑量大蒜素細(xì)胞排列有序，圖1。

圖1 HE染色檢測大蒜素對HF大鼠心肌組織損傷的影響（×200）

2.3 大蒜素對HF大鼠心肌纖維化的影響結(jié)果顯示四組的CVF水平比較差異顯著，其中HF組的CVF（24.81%±2.25%）顯著高于對照組（1.72±0.16%）（P＜0.05），HF+低劑量大蒜素組（14.57%±1.23%）和HF+高劑量大蒜素組大鼠的CVF（7.26%±0.89%）均顯著低于HF組（P＜0.05），其中HF+高劑量大蒜素組顯著低于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05），圖2。

圖2 Masson染色檢測大蒜素對HF大鼠心肌纖維化的影響

2.4 大蒜素對HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響HF組的凋亡指數(shù)（24.52±2.41%）顯著高于對照組（2.06±0.31%）（P＜0.05），HF+低劑量大蒜素組（15.64±1.98%）和HF+高劑量大蒜素組（8.17±1.03%）的凋亡指數(shù)均顯著低于HF組（P＜0.05），其中HF+高劑量大蒜素組顯著低于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05）。

2.5 大蒜素對HF大鼠心肌組織中血管生成情況的影響HF組的血管數(shù)目（19.21±2.26條）顯著低于對照組（28.54±0.32條）（P＜0.05），HF+低劑量大蒜素組（34.78±4.02條）和HF+高劑量大蒜素組（57.25±6.32條）的血管數(shù)目均顯著高于HF組（P＜0.05），其中HF+高劑量大蒜素組顯著高于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05），圖3。

圖3 免疫組化染色檢測大蒜素對HF大鼠心肌組織中血管生成情況的影響

2.6 大蒜素對HF大鼠心肌組織中SIRT3和PPARγ mRNA水平的影響HF組的SIRT3和PPARγ mRNA水平均顯著低于對照組（P＜0.05）。HF+低劑量大蒜素組和HF+高劑量大蒜素組的SIRT3和PPARγ mRNA水平均顯著高于HF組（P＜0.05），且HF+高劑量大蒜素組顯著高于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05），表2。

表2 大蒜素對HF大鼠心肌組織中SIRT3和PPARγ mRNA水平的影響

2.7 大蒜素對HF大鼠心肌組織中SIRT3和PPARγ蛋白水平的影響HF組的SIRT3和PPARγ蛋白水平均顯著低于對照組（P＜0.05）。HF+低劑量大蒜素組和HF+高劑量大蒜素組的SIRT3和PPARγ蛋白水平均顯著高于HF組（P＜0.05），且HF+高劑量大蒜素組顯著高于HF+低劑量大蒜素組（P＜0.05）。

3 討論

心力衰竭目前是發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家最嚴(yán)重的健康問題，缺血性心臟病、高血壓、糖尿病、血脂異常和吸煙等因素均可增加發(fā)生HF的風(fēng)險[10]，目前臨床上尚無特效療法。

大蒜素（2-丙烯-1-磺基硫磺酸S-2-丙烯基酯）是大蒜中的主要活性化合物，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、調(diào)控免疫等作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可劑量依賴性緩解心肌組織損傷，減少纖維化和細(xì)胞凋亡，提高心臟射血功能。此外，大蒜素可劑量依賴性的促進(jìn)血管生成。心肌組織中的血管生成會提高供血供氧水平，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的凋亡并緩解纖維化，提高心功能[12]。Toyga等[13]研究顯示大蒜素通過促進(jìn)血管生成促進(jìn)傷口愈合速度。本研究同時顯示大蒜素可能通過促進(jìn)血管生成減少HF大鼠心肌細(xì)胞的凋亡和纖維化，從而提高HF大鼠的心功能。

SIRT3可通過調(diào)控各種蛋白質(zhì)脫乙酰化來調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，研究顯示其可通過促進(jìn)PPARγ的表達(dá)緩解心肌損傷保護(hù)心功能[14]。內(nèi)皮特異性SIRT3缺失會損害糖酵解和血管生成，且SIRT3可通過PPARγ促進(jìn)血管生成[15]。大蒜素可劑量依賴性的提高SIRT3和PPARγ轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平，通過誘導(dǎo)SIRT家族蛋白的表達(dá)緩解過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[16]。Lin等[17]研究結(jié)果顯示在暴露于氧化的低密度脂蛋白的泡沫細(xì)胞中，大蒜素處理激活了PPARγ相關(guān)信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化功能，提示大蒜素促進(jìn)HF血管生成的機(jī)制可能與SIRT3/PPARγ通路有關(guān)，通過提高心肌細(xì)胞中SIRT3和PPARγ的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，促進(jìn)血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)血管生成。

綜上所述，大蒜素可能通過劑量依賴性的誘導(dǎo)SIRT3/PPARγ通路促進(jìn)血管生成，抑制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化，提高心臟射血功能。但其具體作用和劑量仍需進(jìn)一步的體內(nèi)研究。