李巖,王群林,劉向勇,王偉,牛瑞

1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033；2濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院

納米氧化鋅顆粒大小為1～100 nm，具有獨(dú)特的理化特性和良好的生物相容性,被廣泛應(yīng)用于催化劑、食品、化妝品、抗微生物和抗真菌制劑[1,2]，并越來(lái)越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3,4]，但其安全問(wèn)題仍是科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。納米氧化鋅具有抗微生物活性[5]，可通過(guò)多種復(fù)雜機(jī)制發(fā)揮作用[6]。多項(xiàng)研究[7,8]表明，胃腸道系統(tǒng)是納米氧化鋅的主要靶點(diǎn)。在人體中，腸道菌群種類、數(shù)量通常變化很小，但極易受到外部因素影響從而產(chǎn)生明顯改變。目前，納米氧化鋅對(duì)動(dòng)物腸道菌群的影響國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，2016年12月～2019年1月,本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)觀察了納米氧化鋅腹腔注射后，大鼠腸道菌群分布、種類的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器 雄性昆明小鼠(8～10周齡，18～20 g)6只,購(gòu)自煙臺(tái)綠葉生物有限公司。自由進(jìn)食飲水，室溫25 ℃，光暗周期12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。納米氧化鋅購(gòu)自Sigma公司。基因組抽提試劑盒QIAamp DNA stool minikit購(gòu)自Qiagen公司，QIAquick PCR purification kit試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。MiSeq測(cè)序儀購(gòu)自Illumina 公司。

1.2 動(dòng)物分組及納米氧化鋅腹腔注射 將昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各3只。納米氧化鋅經(jīng)4 RPS超聲處理15 min后懸浮在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天腹腔內(nèi)注射0.2 mL(0.5 g/kg體質(zhì)量)納米氧化鋅溶液，對(duì)照組小鼠以相同頻率腹腔注射等體積的PBS，1次/d，均連續(xù)注射14 d，在藥物干預(yù)結(jié)束后3 d處死小鼠。

1.3 小鼠糞便樣本菌群DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序 處死后截取小鼠結(jié)腸獲得糞便樣品，提取糞便樣本菌群基因組，并擴(kuò)增16S V4區(qū)rDNA。退火溫度為50 ℃，延伸時(shí)間為30 s。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán)、變性94 ℃ 30s 25個(gè)循環(huán)、退火50 ℃ 30 s 25個(gè)循環(huán)、延伸72 ℃ 30 s 25個(gè)循環(huán)，于4 ℃保存。從1%瓊脂糖凝膠中取出PCR產(chǎn)物，并純化。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，截?cái)嗷蛏釛壍唾|(zhì)量序列，連接優(yōu)質(zhì)序列(連續(xù)相同堿基<6；模糊核苷酸N <1)，通過(guò)Illumina 公司的MiSeq測(cè)序儀對(duì)優(yōu)質(zhì)序列組成的DNA文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

根據(jù)優(yōu)質(zhì)序列的相似度，將16S V4區(qū)rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的序列歸為多個(gè)操作分類單元(OTU),通過(guò)尋找最近祖先方法，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息,對(duì)OTU列表中獲得的分類信息與豐度信息進(jìn)行整理，從門、屬水平分別繪制出菌群分布餅圖。進(jìn)一步進(jìn)行物種豐度差異分析(對(duì)同分類的OTU進(jìn)行聚類，對(duì)每個(gè)樣品物種豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。先進(jìn)行F檢驗(yàn)，P<0.05的OTU采用異方差t檢驗(yàn)，P>0.05采用同方差t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。同時(shí)進(jìn)行Alpha多樣性(應(yīng)用mothur軟件計(jì)算出生物多樣性指數(shù)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析判定)、Beta多樣性分析(對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣本聚類得到的文庫(kù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析PCoA，計(jì)算出Unifrac距離矩陣，獲得二維數(shù)據(jù)，繪制應(yīng)用加權(quán)的UniFrac PCoA散點(diǎn)圖，樣本群落組成越相似，則在圖中的距離越接近，群落差異很大的樣本則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi))。生物多樣性相關(guān)指數(shù)，主要有以下3種：豐富度指數(shù)：Chao1/ACE指數(shù)；覆蓋率指數(shù)：good′s coverage；多樣性指數(shù)： Shannon指數(shù)。Chao1/ACE指數(shù)越低，shannon指數(shù)越低，表示群落多樣性越少、結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定、不均一性越高。

2 結(jié)果

6個(gè)糞便樣本中總共獲得腸道菌群71 715個(gè)V4 16S rDNA有效序列，其中優(yōu)質(zhì)序列70 977個(gè)，多分布于225 bp附近。共分析出17門、26綱、42目、64科、115屬。實(shí)驗(yàn)組含有OTU 2 936個(gè)、對(duì)照組含有OTU 2 981個(gè)；兩組共同具有OTU 984個(gè)，所占百分比為19.95%； 兩組OTU總共有4 933個(gè)。兩組都在門水平檢測(cè)出17種，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、柔膜菌門、TM7菌門、脫鐵桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、疣微菌門、螺旋菌門、廣古菌門、綠菌門、梭菌門、黏膠球形菌門、產(chǎn)水菌門、異常球菌-棲熱菌門、浮霉菌門。實(shí)驗(yàn)組厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、柔膜菌門所占百分比分別為39%、33%、25%、3%，對(duì)照組分別為68%、19%、11%、1%。實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道幽門螺桿菌屬、顫桿菌屬、另枝菌屬所占百分比分別為46%、5%、22%，對(duì)照組分別為21%、15%、35% 物種豐度差異性分析顯示：門水平：對(duì)照組多于實(shí)驗(yàn)組2倍差異的門類有廣古菌門、綠菌門、螺旋菌門、TM7 菌門；實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組2倍差異的門類有變形桿菌門、異常球菌-棲熱桿菌門、脫鐵桿菌門、疣微菌門、浮霉菌門、柔膜菌門；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中異常球菌-棲熱桿菌門增多(P=0.042)。屬水平：對(duì)照組多于實(shí)驗(yàn)組2倍差異的屬有17個(gè)，包括厭氧桿菌、布魯菌、埃希菌等；實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組2倍差異的屬有48個(gè)，包括不動(dòng)桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、幽門螺桿菌等；一部分菌屬目前研究較少，甚至尚無(wú)明確的中文名稱；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組臭味菌屬(P=0.038)、顫桿菌屬(P=0.034)減少，而擬桿菌屬增多(P=0.023)。

Alpha多樣性分析結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組生物多樣性指數(shù)Chao、ace、Shannon、coverage分別為4 783.9、9 612.2、4.69、0.912，對(duì)照組分別為5 281.4、11 220.4、5.24、0.892。實(shí)驗(yàn)組多樣性指數(shù)包括Chao1/ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)均低于對(duì)照組，覆蓋率指數(shù)兩者均在0.89以上，說(shuō)明所構(gòu)建文庫(kù)的庫(kù)容足夠大，可代表所研究動(dòng)物腸道菌群中絕大多數(shù)細(xì)菌。Beta多樣性分析結(jié)果:PC1變化率65.97%，提示氧化鋅納米對(duì)實(shí)驗(yàn)組菌群影響的貢獻(xiàn)率為65.97%，PC2變化率17.30%，提示其他某種因素對(duì)兩組菌群影響的貢獻(xiàn)率為17.30%。

3 討論

納米氧化鋅材料被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究[9]表明用作藥物的納米氧化鋅可通過(guò)胃腸道吸收到體內(nèi)，損害腸上皮細(xì)胞，破壞腸屏障，揭示了細(xì)菌易位的可能性。一方面，納米粒子作為載體能將抗微生物劑靶向送至感染部位，提高感染部位藥物濃度使其發(fā)揮更好的抗菌活性[10]，另一方面，多個(gè)研究[11，12]揭示了納米氧化鋅本身對(duì)多種細(xì)菌可產(chǎn)生毒性作用，如大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌等。鑒于納米氧化鋅材料愈加廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其對(duì)微生物的多重作用，我們有必要研究納米氧化鋅干預(yù)對(duì)生物體腸道菌群有何影響，為促進(jìn)或者限制其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

國(guó)內(nèi)外研究[13，14]報(bào)道了納米氧化鋅對(duì)藻類、甲殼類動(dòng)物、脊椎動(dòng)物等具有急性毒性作用，也有研究揭示其神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性、遺傳毒，而對(duì)小鼠腸道菌群有無(wú)影響尚無(wú)報(bào)道。高通量測(cè)序技術(shù)可揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)，近年來(lái)利用此技術(shù)研究生命體、疾病與腸道菌群的關(guān)系有了很大進(jìn)展。本研究中，我們利用高通量測(cè)序技術(shù)觀察小鼠糞便微生物群落特征，并發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在菌群分布、結(jié)構(gòu)上的顯著差異：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別存在2 936和2 981個(gè)OTU，共享OTU的百分比為19.95 %。兩組在門、屬水平微生物分布均不同，各種微生物占比也有差異，提示納米氧化鋅可能會(huì)影響菌群分布、結(jié)構(gòu)；菌群豐度差異分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中異常球菌-棲熱菌門增多，擬桿菌屬增多，臭味桿菌屬和顫桿菌屬較對(duì)照組減少，說(shuō)明兩組菌群分布、結(jié)構(gòu)的差異，這可能是納米氧化鋅影響的結(jié)果，但這些變化是納米氧化鋅破壞腸屏障導(dǎo)致細(xì)菌易位抑或納米氧化鋅本身抑菌活性的結(jié)果，還是兩者均對(duì)腸道菌群改變產(chǎn)生一定影響，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)差異性菌群主要為國(guó)內(nèi)外研究較少的菌種，提示對(duì)這些相對(duì)陌生菌屬進(jìn)行深入研究很有必要。

通過(guò)對(duì)小鼠糞便菌群的測(cè)序分析，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在菌群種類多樣性上亦存在顯著差異。Alpha多樣性通常指一個(gè)特定生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，可反映豐富度和均勻度，一方面與種類數(shù)目即豐富度有關(guān)，另一方面與多樣性有關(guān)，提示整個(gè)群落中個(gè)體分配上的均勻性。Beta多樣性分析是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，揭示群落組成變化、分化的程度，與環(huán)境的復(fù)雜梯度或環(huán)境的模式有關(guān)，用變化率表示，以此判定物種對(duì)環(huán)境異質(zhì)性的反應(yīng)，并指示各樣本的相似性。本研究中Alpha多樣性分析示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組生物多樣性指數(shù)均下降，提示納米氧化鋅組腸道菌群多樣性減少且不均一性增加；Beta多樣性分析提示納米氧化鋅對(duì)實(shí)驗(yàn)組菌群影響較大(貢獻(xiàn)率約占65.97%)，且與對(duì)照組樣本文庫(kù)相對(duì)獨(dú)立，對(duì)照組樣本個(gè)體相似性相對(duì)較高，而實(shí)驗(yàn)組樣本個(gè)體對(duì)環(huán)境異質(zhì)性反應(yīng)差異較大。

綜上所述，氧化鋅納米腹腔注射后, 小鼠腸道菌群多樣性減少,不均一性增加。我們首次利用高通量測(cè)序技術(shù)初步觀察了氧化鋅納米腹腔注射后小鼠腸道菌群分布及種類的變化，填補(bǔ)了納米氧化鋅暴露對(duì)腸道菌群影響研究的空白。 本研究篩選的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群是否通過(guò)各自的生物學(xué)特性顯著影響機(jī)體某方面功能仍需明確，是我們下一步研究重點(diǎn)。