鄭志遠(yuǎn)，吳和明，李仲堅(jiān)

梅州市人民醫(yī)院，廣東梅州 514000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)全球的長(zhǎng)期公共衛(wèi)生問題。在世界范圍內(nèi)，有超過20億人感染過HBV和大約3.5億人發(fā)展為慢性感染者[1,2]。慢性HBV感染是發(fā)展成終末期肝臟疾病(包括肝硬化、肝衰竭、肝癌)的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，中國(guó)HBV攜帶者約7 800萬，每年約有30萬人死于HBV相關(guān)的肝硬化或肝癌[3]。目前，慢性乙型肝炎的治療主要有干擾素和核苷(酸)類似物(NAs)兩類藥物[4,5]。其中NAs療效明顯，不良作用小，臨床應(yīng)用廣泛。但長(zhǎng)期NAs治療有可能使得患者體內(nèi)的HBV序列發(fā)生變異，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷(酸)類似物結(jié)合力降低，變異的HBV不受核苷(酸)類似物的抑制或抑制能力下降從而導(dǎo)致治療失敗[6,7]。有研究[8,9]報(bào)道,HBV基因型和耐藥突變與疾病惡化有關(guān)。研究耐藥突變情況與HBV基因分型之間的關(guān)系對(duì)乙型肝炎患者的治療有重要指導(dǎo)意義。HBV主要有8種基因分型(A～H)[10]，它們中大多數(shù)有獨(dú)特的地域分布[11,12]。本研究以梅州地區(qū)客家人群525例慢性HBV感染患者為研究對(duì)象，觀察其基因型分布情況,并比較了不同HBV基因型患者NAs耐藥情況、耐藥突變位點(diǎn)及病情，以期為慢性HBV感染患者的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年1～12月梅州市人民醫(yī)院住院的客家人慢性HBV感染患者525例,男422例、女103例，年齡(48.31±11.27)歲；慢性乙型肝炎284例，肝硬化157例，肝癌84例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[13]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；肝癌診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[14]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；均采用NAs治療并都進(jìn)行了HBV基因分型和耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)；患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有自身免疫性肝炎、丙型肝炎、酒精性肝硬化、膽汁淤積性肝病等可引起肝臟病變的其他疾病者。本研究經(jīng)過了梅州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患者均知情同意。

1.2 血清HBV-DNA載量、HBV-DNA基因分型和耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè) 抽取患者空腹靜脈血3 mL后，采用磁珠法提取患者血液中的病毒核酸，提取過程由PerkinElmer公司Pre-NAT全自動(dòng)核酸檢測(cè)反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)完成，試劑盒購自上海浩源生物技有限公司，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。高濃度胍鹽將病毒蛋白外殼裂解，釋放出病毒核酸，再用對(duì)核酸具有吸附功能的磁珠將游離的病毒核酸吸附到磁珠表面。洗去未吸附上的雜質(zhì)，最后將病毒核酸從磁珠上洗脫下來作為測(cè)定用模板。然后將配制好的反應(yīng)混合液分裝到擴(kuò)增反應(yīng)管中，再依次加入標(biāo)本模板、陰陽對(duì)照及定量參考品。離心混勻后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)出血清中HBV-DNA載量。

將直用型PCR反應(yīng)液加入反應(yīng)管中，再分別加入上述制備好的模板，離心混勻上機(jī)擴(kuò)增。取20 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物至110 μL雜交液中，混勻后加入基因芯片孔中，然后分別按說明書步驟操作，最后分別用基因分型、耐藥突變位點(diǎn)閱讀儀判讀HBV-DNA基因分型、HBV-DNA耐藥突變位點(diǎn)。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBV分型檢測(cè)芯片陰性對(duì)照檢測(cè)為陰性、陽性對(duì)照檢測(cè)為TypeB陽性、質(zhì)控探針至少2個(gè)顯示為陽性，則分型檢測(cè)結(jié)果有效。芯片上各型別對(duì)應(yīng)位置3個(gè)點(diǎn)中，至少2個(gè)信號(hào)點(diǎn)出現(xiàn)陽性信號(hào)即可判斷為該型別為陽性。

HBV耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)芯片陰性對(duì)照探針檢測(cè)為陰性、空白對(duì)照為陰性、陽性對(duì)照探針檢測(cè)為陽性并且至少有4個(gè)顯示為陽性、質(zhì)控探針至少2個(gè)顯示為陽性則耐藥檢測(cè)結(jié)果有效。芯片上HBV各型別對(duì)應(yīng)位置3個(gè)點(diǎn)中，至少兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)出現(xiàn)陽性即可判為陽性。

1.3 血清肝功能指標(biāo)及甲胎蛋白(AFP)的檢測(cè) 空腹抽靜脈血2 mL，用3 000 r/min離心5 min后放室溫待檢。采用全自動(dòng)生化分析儀(AU5821，Beckman Coulter)檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，檢測(cè)試劑購自上海科華生物工程有限公司；采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)血清AFP，儀器采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(Architect i2000，雅培)，檢測(cè)試劑購自雅培公司。

2 結(jié)果

2.1 525例客家慢性HBV感染者HBV基因型分布 525例患者中B基因型463例(88.19%)，C基因型59例(11.24%)，B+C型、B+D型和D型各1例，各占0.19%。B、C基因型慢性HBV感染者男性分別為369例(79.70%)、50例(84.75%)，年齡分別為(47.33±14.70)歲、(43.86±14.34)歲，兩基因型慢性HBV感染者男性比例及年齡比較，P均>0.05。

2.2 不同基因型HBV拉米夫定、阿德福韋脂的耐藥位點(diǎn)及耐藥率 在525例客家慢性HBV感染者中，位點(diǎn)突變475例(90.48%)，其中HBV B基因型421例、HBV C基因型54例(由于HBV B+C型、HBV B+D型、HBV D型例數(shù)較少，未納入統(tǒng)計(jì))。525例客家慢性HBV感染者中，437例對(duì)拉米夫定耐藥，18例對(duì)阿德福韋脂耐藥，20例為多重耐藥。

對(duì)拉米夫定耐藥的437例慢性HBV感染者中，B基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt180M、rt204V、rt204I、rt180M+rt204V者分別為52(13.30)、32(8.18)、22(5.63)、285例(72.89)，C基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt180M、rt204V、rt204I、rt180M+rt204V者分別為12(26.09%)、1(2.17%)、4(8.70%)、29例(63.04%)，B基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt180M+rt204V者的比例最高。

對(duì)阿德福韋酯耐藥的18例慢性HBV感染者中，B基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt181V、rt181T、rt236T、rt181V+rt181T者分別為3、2、5、1例，C基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt181V、rt181T、rt236T、rt181V+rt181T者分別為2、1、3、1例。B基因型HBV耐藥位點(diǎn)為rt236T者的比例最高。

284例慢性乙型肝炎患者中，耐藥者為259例(91.20%)；154例肝硬化患者中，耐藥者為141例(91.56%)；84 例肝癌患者中，耐藥者為75例(89.29%)，三者之間耐藥率比較，P>0.05。

2.3 不同基因型HBV慢性感染者血清AST、ALT、AFP、HBV-DNA及肝硬化、肝癌比例比較 B基因型HBV慢性感染者AST、ALT、AFP、HBV-DNA水平分別為(181.25±49.53)IU/L、(184.93±27.47)IU/L、(111.33±14.55)ng/mL、(5.15±1.66)IU/mL。C基因型HBV慢性感染者AST、ALT、AFP、HBV-DNA分別為(177.34±37.07)IU/L、(310.32±39.77)IU/L、(107.50±10.44)ng/mL、(5.23±1.72)IU/mL。 B、C基因型HBV慢性感染者血清AST、AFP、HBV-DNA水平比較，P均>0.05；血清ALT水平比較，P<0.05。

B基因型HBV慢性感染者中，慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌者分別為276(97.18%)、120(77.92%)、67例(79.76%)，C基因型分別為8(2.82%)、34(22.08%)、17例(20.24%)，C基因型肝硬化、肝癌的比例高于B基因型(P均<0.05)。

3 討論

HBV是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA病毒[15,16]。它最顯著的生物學(xué)特征就是變異率高。HBV的4個(gè)基因S、C、P和X在自然條件下均可發(fā)生變異[17,18]。這些變異引起病毒的生物學(xué)改變，導(dǎo)致變異后病毒感染者血清HBeAg陰性，但HBV仍在復(fù)制，引起免疫逃逸。此外，慢性HBV感染者需要長(zhǎng)時(shí)間甚至終身抗病毒治療，使得病毒被持續(xù)抑制。這樣，很多患者中就不可避免地出現(xiàn)耐藥突變體，從而導(dǎo)致了病毒學(xué)和生化突破。耐藥突變體的發(fā)展也大大降低了治療慢性HBV感染的功效，使疾病進(jìn)展和肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加[19，20]。

通過對(duì)不同HBV基因型之間的性別、年齡、AST、ALT、AFP和HBV-DNA載量的比較發(fā)現(xiàn)B基因型和C基因型HBV慢性感染者的ALT水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALT是反映肝臟功能的重要指標(biāo)，C基因型HBV慢性感染者的ALT值高于B基因型，說明C基因型HBV慢性感染者肝細(xì)胞進(jìn)行性壞死程度更大，與曾華等[21]研究結(jié)果相符。臨床常用干擾素和NAs進(jìn)行抗病毒治療，對(duì)于長(zhǎng)期使用NAs治療的患者，對(duì)其進(jìn)行HBV基因型和耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)，有助于臨床醫(yī)生了解患者疾病的發(fā)展情況，為其及時(shí)調(diào)整用藥。本研究中，對(duì)拉米夫定耐藥的437例患者中以B基因型為主，耐藥位點(diǎn)以rt180M+rt204V最多見，患者的耐藥比例最高為72.89%。說明拉米夫定已嚴(yán)重耐藥，不再適合作為臨床的一線用藥。對(duì)阿德福韋脂耐藥的18例中以B基因型為主，耐藥位點(diǎn)以rt236T最多見，耐藥患者比例最高為45.45%，提示阿德福韋單獨(dú)應(yīng)用的耐藥發(fā)生率也較高。我們還發(fā)現(xiàn)HBV基因型B和C在肝硬化、肝癌的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C基因型慢性HBV感染患者發(fā)展為肝硬化、肝癌的比例遠(yuǎn)高于B基因型慢性HBV感染患者，與文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道一致。這可能與C基因型HBV的高復(fù)制能力導(dǎo)致HBV DNA和病毒抗原在細(xì)胞內(nèi)聚集，從而引起肝細(xì)胞損傷有關(guān)；也與C基因型HBV患者易產(chǎn)生自發(fā)性酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸變異密切相關(guān)[24,25]。HBV基因型分布具有地域性，我國(guó)以B、C基因型為主，本研究中，525例梅州客家慢性HBV感染患者中，基因型以B型為主，與以往研究[26]結(jié)果一致。

綜上所述，梅州地區(qū)客家人群HBV基因型以B基因型為主。HBV B基因型慢性感染者拉米夫定耐藥位點(diǎn)以rt180M+rt204V最為多見，阿德福韋酯耐藥位點(diǎn)以rt236T最為多見。HBV B基因型慢性感染患者病情輕于C基因型。本研究還存在一定的局限性。首先，我們對(duì)HBV基因型和耐藥位點(diǎn)的分析只是基于一個(gè)血液樣本獲得的研究資料。因此，無法評(píng)估HBV基因型或耐藥位點(diǎn)變化對(duì)疾病發(fā)展的影響。其次，入選的樣本都是住院客家患者，病情偏重，可能造成選擇性偏倚。