陳菊艷 陳銳 鄧倫秀

貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005

0 引言

朱砂根(Ardisiacrenata)是紫金牛科紫金牛屬的常綠小灌木，又名富貴籽[1]、鐵涼傘、大羅傘、平地木、黃金萬兩、涼傘遮金珠等。朱砂根果實(shí)多、色澤艷麗、觀果期長達(dá)半年以上；該種除果實(shí)具有觀賞價(jià)值外，葉形、葉色、冠型等也具有很高的觀賞性，是極佳的室內(nèi)觀葉、觀果盆栽木本花卉，也是園林中重要的常綠灌木[2-4]。目前對(duì)朱砂根研究主要集中在形態(tài)特征、資源分布、繁殖技術(shù)[5-6]、生理生化等方面的研究[7]，還未涉及到開花生物學(xué)特性和花粉生活力等方面的研究，在常規(guī)育種中，為了進(jìn)行人工輔助授粉或雜交育種，需要采集和貯藏花粉，因而了解朱砂根的開花生物學(xué)特性和花粉生活力測(cè)定，對(duì)于雜交育種工作意義重大。為此，本研究針對(duì)朱砂根的開花生物學(xué)特性和花粉生活力、花粉萌發(fā)等問題做了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貴州省林業(yè)科學(xué)研究院“野生珍稀花木繁育中試基地”中繁殖的朱砂根為試驗(yàn)材料，是2015年10月從榕江縣計(jì)劃大山采集的種子播種繁殖的植株。常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理，植株已進(jìn)入生殖成熟階段。在盛花期取花枝中上部當(dāng)天開放的花朵，帶回實(shí)驗(yàn)室用鑷子去除藥帽，然后分裝入2.0ml的eppendorf管內(nèi)，貼好標(biāo)簽備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 開花習(xí)性

(1)花部特征

分別隨機(jī)選取15株，統(tǒng)計(jì)每株的花序數(shù)，每個(gè)花序單花數(shù)隨機(jī)取開放的花朵用游標(biāo)卡尺直接測(cè)量花柄、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊等的大小。

(2)開花動(dòng)態(tài)

在花蕾期，標(biāo)記30株，每株標(biāo)記至少3個(gè)花序；每2-3天觀察一次花蕾，直至花朵開放；花朵開放當(dāng)天，每隔2-3小時(shí)觀察1次，此后，每天觀察1次，直至花朵脫落或成為果實(shí)；每次觀測(cè)，均注意記錄開花數(shù)量、開放時(shí)間、花瓣伸展、花粉散出、柱頭伸長、單花花期；注意記錄花朵結(jié)構(gòu)的數(shù)目、形狀、大小、顏色等。

(3)開花物候

在觀察群體內(nèi)選擇大小基本一致的30株個(gè)體，并在樣株上隨機(jī)標(biāo)記一個(gè)花序，記錄花序和植株上每天開花的數(shù)量。花序和個(gè)體水平的開花物候參數(shù)以所標(biāo)記的全部花序和個(gè)體的平均值計(jì)算。觀察和統(tǒng)計(jì)的開花參數(shù)主要有始花日期、開花高峰日期、持續(xù)時(shí)間和終花日期?；ㄐ蚝蛡€(gè)體的始花日期為第一朵花在花序和個(gè)體上開花的日期，花序和個(gè)體開花數(shù)大于或等于50%時(shí)為開花高峰日期，無花開放時(shí)為終花日期；群體水平(以樣地為標(biāo)準(zhǔn))以25%的個(gè)體開花時(shí)視為始花日期，95%的植株開花結(jié)束時(shí)視為群體終花日期。

1.2.2 花粉活力測(cè)定、貯藏及萌發(fā)研究

(1)花粉活力測(cè)定

分別用TTC法和I2-KI法測(cè)定花粉活力[8]。

①TTC染色法測(cè)花粉活力：取新鮮花粉，將少量花粉置于載玻片上，加1-2滴0.5%的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液，蓋上蓋玻片；將制片放在35℃恒溫箱中3-4h，然后在低倍鏡下觀察，凡是染成紅色的花粉其活力為強(qiáng)，淡色次之，原色為不具有活力的花粉；觀察3個(gè)制片，每片取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100粒左右花粉，然后計(jì)算花粉活力百分率。

②I2-KI法：將少量花粉置于載玻片上，加1-2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，花粉染成藍(lán)色的為活力最強(qiáng)，黃褐色的活力較弱或不具有活力。

采用以上兩種測(cè)定方法，每個(gè)處理重復(fù)五次，每次取三個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100粒左右花粉，計(jì)算花粉活力百分率。

花粉生活力=(染色的花粉數(shù)量/花粉數(shù)量)× 100%

(2)花粉的貯藏

將采集的花粉分別儲(chǔ)藏在室內(nèi)常溫25℃、冰箱4℃冷藏、冰箱-20℃冷凍貯藏條件下，每天檢測(cè)一次花粉生活力。

表1 不同培養(yǎng)基配比

(3)花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基篩選

固體培養(yǎng)法測(cè)花粉活力：①培養(yǎng)基主要成分為CaCl2、H3bO4、蔗糖、瓊脂，培養(yǎng)溫度為25℃，設(shè)計(jì)以下九種培養(yǎng)基(表1)分別均勻倒于一般載玻片上，在表面形成2-4mm的一層培養(yǎng)基，用毛筆蘸取少量朱砂根的花粉，輕輕撒在表面，每個(gè)處理做三次重復(fù)，把載玻片置于培養(yǎng)皿中保濕，再置入25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)12h以上，然后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)的情況，每個(gè)重復(fù)取3-5個(gè)視野，以花粉管的長度大于花粉粒的直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)重復(fù)觀察花粉數(shù)不少于30粒，按下式計(jì)算萌發(fā)率，萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉粒數(shù)目/花粉總數(shù)×100%，用篩選出來的最適培養(yǎng)基來測(cè)定其活力，測(cè)定方法同(1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel2009進(jìn)行圖表的繪制。利用SPSS18.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂根開花習(xí)性

2.1.1 花部特征

朱砂根為傘形或近傘形花序，通常生于側(cè)生伸長的特殊花枝頂端；雌雄同花，花枝長5-18cm，花長6mm，白色或略帶淡紅色，花萼和花瓣均5裂，偶見4裂或6-7裂；萼片卵形或矩圓形，先端鈍，長1.88mm或更短，寬1.45mm，有銹色腺點(diǎn)；花瓣長5.38mm，寬1.04mm；雄蕊短于花冠裂片，短于雌蕊，5枚，偶見4枚，花藥披針形，長3.16mm，寬1.04mm，背面有銹色腺點(diǎn)，無明顯的花絲。單心皮雌蕊，子房上位，綠色，橢圓球型，長1.12mm，寬1.10mm，一室，花柱和子房上均具黑褐色腺點(diǎn)；整個(gè)花部無蜜腺，各個(gè)指標(biāo)的平均值見表2。

表2 朱砂根花部特征測(cè)定表

2.1.2 開花動(dòng)態(tài)

(1)單花開放動(dòng)態(tài)

觀察2018年6月15日開始，朱砂根的花萼開始向外裂開，6月22日白色的花瓣開始微裂，6月26日13∶40開始，萼片完全打裂開，下午14∶18第一枚花瓣微張，15∶30有兩枚花瓣同時(shí)也微微裂開，可見黃色的花藥和微露的柱頭，17∶15觀察到最后兩枚花瓣裂開，可見黃色花藥緊貼花柱，觀察到其中一個(gè)花藥頂端己經(jīng)開裂，有少量花粉散出，6月27日8∶30五枚花瓣開放程度加大，與花藥夾角60度左右，花瓣離生，10∶30花瓣與花藥幾乎呈90度開放，15∶30花瓣開始微微反卷；6月28日上午9∶30觀察到花瓣繼續(xù)向下反卷，花藥幾乎全部裂開，花粉大量散出，至下午16∶00左右花瓣開始變軟并進(jìn)一步反卷，花藥完全爆開，由于花粉逐漸的散出，花藥呈萎縮狀態(tài)，開始干癟變小，6月29日上午10∶00花瓣開始脫落。朱砂根單花開放持續(xù)時(shí)間大約為3d，但也有花朵開放2d或4d后花瓣就開始萎蔫脫落。

(2)花序開放動(dòng)態(tài)

朱砂根的花序是傘形或近傘形花序，開花的時(shí)候往往最先長出的花蕾先開，一個(gè)花序有5-40朵小花，在觀察的30組花序里，從第一朵小花開始開放到最后一朵結(jié)束，一個(gè)花序平均的花期持續(xù)10d，而所標(biāo)記的30株個(gè)體，從第一朵開放到最后一朵凋謝為止，單株的平均花期是22d。

(3)開花物候

朱砂根一年只開一次花，不同種源開花時(shí)期有所差異。榕江種源花期為5月底到6月中旬，花期30d左右，群體水平上始花期在5月24日，盛花期在6月5日，終花期在6月20日左右；福建種源花期為6月底到7月底，花期30d左右，群體水平上表現(xiàn)為始花期在6月25日左右，盛花期在7月10日左右，終花期8月初(表3)。同一種源生長環(huán)境不同，花期也有所差異，差異大概在15d左右。

表3 不同種源開花時(shí)期

2.1.3 朱砂根花粉活力測(cè)定、貯藏及萌發(fā)研究

(1)不同方法測(cè)定花粉活力

花粉活力采用碘化鉀法測(cè)定見圖1，用TTC法測(cè)定見圖2，結(jié)果表明：碘化鉀法染色的花粉粒均為黃褐色，無法測(cè)出朱砂根花粉活力，而TTC法染色后的花粉粒部分為紅色，表明花粉活力很強(qiáng)，部分為粉色，表明花粉活力一般，還有一部分為白色，表明花粉失活，因此，TTC法適用于朱砂根花粉活力的測(cè)定。

圖1 碘化鉀法染色的花粉粒

圖2 TTC法染色的花粉粒

(2)花粉貯藏方法

花粉TTC染色具體結(jié)果見表4和圖3、圖4、圖5、圖6。朱砂根花粉脫離植株1小時(shí)后 TTC活力測(cè)定在80%以上，三種花粉儲(chǔ)藏方式第一天在常溫25℃和-20℃條件下花粉均失去活力，只有在4℃條件下保存的花粉活力為60%左右，第二天花粉活力在10%左右，第三天后為0。由此可見，朱砂根花粉不耐高溫，也不耐低溫，在-20℃條件下儲(chǔ)藏其花粉活力反而更低，三種花粉儲(chǔ)藏方式下4℃最適宜花粉的保存，且保存時(shí)間為3天。常溫25℃與-20℃均不適宜花粉的保存，保存一天花粉均失去活力。

表4 花粉活力TTC染色結(jié)果

圖3 采取花粉當(dāng)天 (TTC法)

圖4 第二天4℃冷藏(TTC法)

圖5 第三天4℃冷藏(TTC法)

圖6 第四天 4℃冷藏(TTC法)

2.1.4 花粉的萌發(fā)

(1)花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

對(duì)朱砂根花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，其各個(gè)培養(yǎng)基萌發(fā)率見圖7，萌發(fā)率的大小依次為9號(hào)>6號(hào)>1號(hào)>5號(hào)>2號(hào)>3號(hào)>7號(hào)>4號(hào)>8號(hào)，方差分析見表5和表6；9號(hào)培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率最好，9號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基之間有極顯著差異。9號(hào)、6號(hào)和其他培養(yǎng)基之間有極顯著差異，4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和其他培養(yǎng)基之間有差異，4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)組內(nèi)無顯著差異，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)基之間有顯著差異，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)培養(yǎng)基組內(nèi)無顯著差異，9號(hào)培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)基之間有極顯著差異；所以篩選出來的最佳培養(yǎng)基是9號(hào)(0.2%CaCl2+0.03%H3BO4+20%蔗糖+10%PEG4000)。各培養(yǎng)基下花粉萌發(fā)情況見圖8。

圖7 不同培養(yǎng)基下的花粉活力

表5 不同培養(yǎng)基花粉活力染色法差異比較

表6 花粉離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的方差分析

培養(yǎng)基1號(hào)

培養(yǎng)基2號(hào)

培養(yǎng)基3號(hào)

培養(yǎng)基4號(hào)

培養(yǎng)基5號(hào)

培養(yǎng)基6號(hào)

培養(yǎng)基7號(hào)

培養(yǎng)基8號(hào)

培養(yǎng)基9號(hào)

3 結(jié)論與討論

(1)朱砂根為傘形或近傘形花序，一個(gè)花序有5-40朵小花，通常生于側(cè)生伸長的特殊花枝頂端；花白色或略帶淡紅色，花萼和花瓣均5裂，偶見4裂或6、7裂；萼片卵形或矩圓形；雄蕊短于花冠裂片，短于雌蕊，5枚，偶見4枚，花藥披針形，背面有銹色腺點(diǎn)，無明顯的花絲；單心皮雌蕊，子房上位，綠色，橢圓球型，花柱和子房上均具黑褐色腺點(diǎn)；整個(gè)花部無蜜腺。朱砂根單花開放持續(xù)的時(shí)間約為3d，一個(gè)花序平均的花期為10d，單株的平均花期是22d。朱砂根一年只開一次花，產(chǎn)地不同花期不同，環(huán)境不同花期也不同，花的開放主要受溫度因素影響較大。

(2)用碘化鉀法和TTC法測(cè)定朱砂根花粉活力，結(jié)果表明：TTC法較適合測(cè)定，朱砂根花粉不耐高溫和低溫，在-20℃條件下儲(chǔ)藏其花粉活力反而更低，三種花粉儲(chǔ)藏方式下4℃最適宜花粉的保存，且保存時(shí)間為3d。對(duì)朱砂根花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，篩選出來的最佳培養(yǎng)基是(0.2%CaCl2+0.03%H3BO4+20%蔗糖+10%PEG4000)萌發(fā)率為75%。所以，選取朱砂根作為雜交親本進(jìn)行人工授粉時(shí)，避免因花粉貯藏中失活，應(yīng)采取隨采集隨授粉的方式，保證雜交育種工作的順利進(jìn)行。