劉 芬，鄒長棪，胡 丹，王曉寧，鄭雄偉，蘇 穎，林賢東

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)屬于γ-DNA線性雙鏈?zhǔn)攘馨图?xì)胞病毒，EBV與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如鼻咽癌、T細(xì)胞淋巴瘤及機(jī)會性淋巴瘤等[1]。近年EBV相關(guān)胃癌(Epstein-Barrvirus-associated gastric carcinoma, EBVaGC)已逐漸被人們認(rèn)識。采用PCR、DNA原位雜交和EBER原位雜交技術(shù)檢測胃癌組織中EBV相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)EBV與某些胃癌發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[2]。2014年Cancer Genome Atlas Research Network正式將EBVaGC作為獨(dú)立的亞型提出[3]。EBVaGC的發(fā)生、發(fā)展與普通胃癌有差異，但具體機(jī)制尚不清楚。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各過程，具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-6]。前期lncRNA芯片篩選及數(shù)據(jù)分析顯示lncRNA RNU12在EBVaGC中特異表達(dá)[7]，但其在EBVaGC作用尚不清楚。本文旨在探討EBV感染與胃癌的相關(guān)性，以及RNU12表達(dá)與胃癌臨床病理特征、EBV感染的關(guān)系，為EBVaGC的治療、控制和預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選取2012年7月～2015年4月福建省腫瘤醫(yī)院接受胃癌切除的113例胃腺癌患者，其中EBVaGC患者46例?；颊吣行?9例和女性24例，中位年齡為59歲(四分位數(shù)間距：22.0～82.0歲)。腫瘤直徑中位數(shù)為5.5 cm(四分位距：1.0～15.0 cm)。按第8版AJCC分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期26例，Ⅲ期64例，Ⅳ期10例；根據(jù)Lauren組織學(xué)分型：腸型77例，彌漫型36例?；颊呤中g(shù)前未接受任何化療。腫瘤切除后立即將一部分新鮮腫瘤組織和鄰近的非腫瘤胃組織經(jīng)液氮快速冷凍并于-80 ℃儲存，另一部分經(jīng)10%中性福爾馬林中固定，并石蠟包埋。

1.2 方法113例胃癌標(biāo)本采用組織芯片制作機(jī)細(xì)針打孔的方法，從眾多的組織蠟塊(供體蠟塊)中采集數(shù)十至上百個圓柱形小組織(組織芯)，并將其整齊排列于另一空白蠟塊(受體蠟塊)中，制成組織芯片蠟塊。

1.3 EBV原位雜交檢測EBV原位雜交檢測采用EBER1檢測試劑盒，將組織芯片蠟塊切片、烤片、脫蠟、脫水及蛋白酶K消化約5 min，滴加EBV核酸探針(Epstein-Barr encoded RNA)雜交液，55 ℃孵育90 min，37 ℃孵育過夜。一抗孵育30 min，二抗孵育20 min。洗滌擦干，滴加辣根過氧化物酶反應(yīng)30 min；滴加DAB復(fù)合物顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。

1.4 qRT-PCR檢測取100 mg的凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol，靜置10 min后抽提mRNA。使用分光光度計(jì)測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將提取RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)時熒光定量PCR按SyberGreen說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s，40個循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線檢測。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參基因與各基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化對照，同時以T-17892癌組織表達(dá)(calibrator)對其他標(biāo)本進(jìn)行量化，即它的表達(dá)量設(shè)為1，量化其他樣本的表達(dá)量；采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量的RQ值，為了便于統(tǒng)計(jì)，把RQ值取log10進(jìn)行分析[8]。RNU12上游引物：5′-TGACGCCCGAA TCCTCAC-3′；下游引物：5′-ATCGCAACTCCCAGGCA TC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCAGAACATCATCCCT GCCT-3′，下游引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

2 結(jié)果

2.1 EBV感染與胃癌臨床病理特征的關(guān)系EBV原位雜交結(jié)果顯示，113例胃腺癌中，46例EBER陽性，細(xì)胞核呈棕褐色。EBVaGC多表現(xiàn)為潰瘍型或凹陷型腫物，具有淋巴上皮瘤樣組織學(xué)、中低分化腺癌伴大量淋巴細(xì)胞浸潤等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(圖1)。EBV感染與患者年齡、分化程度、Lauren分型及腫瘤大小相關(guān)(P<0.05，表1)；與患者性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管癌栓及神經(jīng)侵犯無關(guān)(P>0.05，表1)。

圖1 胃癌的EBER原位雜交：A.EBVaGC中EBER呈陽性；B.非EBVaGC中EBER呈陰性

表1 EBV感染與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 胃癌、癌旁組織中RNU12的表達(dá)利用qRT-PCR檢測113例胃癌及癌旁組織中RNU12的表達(dá)水平，胃癌組織中RNU12的表達(dá)量為(0.01±0.004)(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量為(0.179±0.001)，下調(diào)3.35倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，圖2)；表明RNU12在胃癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。

圖2 qRT-PCR法檢測RNU12 在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)：紅線表示每組的平均值

2.3 胃癌中RNU12表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組30例，RNU12的平均表達(dá)量0.167；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組83例，平均表達(dá)量為-0.061，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。按照EBV原位雜交檢測分為EBVaGC和EBV陰性胃癌，EBVaGC組46例，RNU12的平均表達(dá)量0.108；EBV陰性胃癌組67例，平均表達(dá)量為-0.075，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)，表明EBV感染影響RNU12表達(dá)。RNU12表達(dá)與患者性別、年齡，腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度、Lauren分型、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯及TNM分期無明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 胃癌中RNU12表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 EBVaGC及癌旁組織中RNU12的表達(dá)通過EBER檢測分析，113例胃癌患者中有46例為EBVaGC。46例EBVaGC中RNU12的表達(dá)量為(0.130±0.090)(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量為(0.393±0.093)，下調(diào)3.0倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023，圖3)，提示RNU12在EBVaGC組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。

圖3 qRT-PCR法檢測RNU12在EBVaGC及癌旁組織中的表達(dá)：紅線表示每組的平均值

2.5 EBVaGC中RNU12 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系將EBVaGC按照WHO(2018) 胃腫瘤組織學(xué)進(jìn)行分類，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期12例，RNU12的平均表達(dá)量為0.392；Ⅲ+Ⅳ期34例，平均表達(dá)量為0.008，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組：淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組11例，RNU12的平均表達(dá)量0.535；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組35例，平均表達(dá)量為-0.026，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。按浸潤深度：0.05，表3)。

表3 EBVaGC中RNU12表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.6 RNU12表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系46例EBVaGC組織中RNU12的相對表達(dá)量lgRQ符合正態(tài)分布，故取中位數(shù)0.074將其分為高表達(dá)組(24/78)和低表達(dá)組(22/78)。RNU12高表達(dá)組24例，死亡5例(20.8%)，平均生存時間(64±26.0)個月；RNU12低表達(dá)組22例，死亡13例(59.1%)，平均生存時間(39.9±6.8)個月。采用Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線，結(jié)果顯示RNU12高表達(dá)組總生存率高于低表達(dá)組(P=0.008，圖4)。

圖4 胃癌患者預(yù)后生存分析

3 討論

EBV屬于皰疹病毒具有長約184 kb的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，內(nèi)編碼大于85個基因組。EBV與其他皰疹病毒類似，有一個環(huán)形蛋白核心，外面由雙鏈DNA包繞。EBV感染人體后可引起體液免疫和細(xì)胞免疫，卻能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊的機(jī)制及其致癌特征[9]。EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤發(fā)生有明確聯(lián)系的病毒，長期感染可引起鼻咽癌、傳染性單核細(xì)胞增多癥、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤等惡性腫瘤[10]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子[1]。EBVaGC約占胃癌的10%，預(yù)計(jì)每年新增的EBVaGC有80 000多例[2]。2014年Cancer Genome Atlas Research Network[3]對295例胃癌的綜合性分子分析及數(shù)據(jù)整合研究，提出新的胃癌分子分型方法，將胃癌分為4個亞型：EBVaGC、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、基因組穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型，正式將EBVaGC歸為獨(dú)立的亞型。本實(shí)驗(yàn)顯示EBV感染與患者年齡、組織分化、Lauren’s分型、腫瘤直徑密切相關(guān)。研究表明，EBVaGC具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，包括PIK3-CA通路突變、DNA超甲基化、PD-L1和PD-L2基因拷貝數(shù)增加等分子特征[3]。以上結(jié)果提示，EBV可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。

lncRNA指長度在200個核苷酸以上且不能編碼蛋白質(zhì)的RNA。lncRNA是近年研究熱點(diǎn)，作為關(guān)鍵調(diào)控分子參與基因調(diào)控，涉及表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后，主要作為信號分子(signal)、誘餌分子(decay)、引導(dǎo)分子(guide)、支架分子(scaffold)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。lncRNA與胃癌的研究也備受關(guān)注，在胃癌中發(fā)現(xiàn)lncRNA LEIGC在癌組織中的表達(dá)量低于癌旁和正常組織，過表達(dá)LEIGC通過上調(diào)E-cadherin，下調(diào)vimentin及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步抑制EMT過程，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[12]。lncRNA PVT1與FOXM1相互作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，可能成為胃癌的預(yù)后標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)[13]。本實(shí)驗(yàn)表明RNU12在胃癌組織與癌旁組織中表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)，且其異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及EBV感染密切相關(guān)，進(jìn)一步證明lncRNA異常表達(dá)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

EBV調(diào)控的宿主lncRNA在上皮性癌中發(fā)揮重要作用[14]。幾乎所有鼻咽癌患者中均發(fā)現(xiàn)持久性潛伏EBV感染。Li等[15]通過NGS測序技術(shù)分析7例鼻咽癌組織和7例正常鼻咽組織的lncRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：2 192個lncRNA異常表達(dá)，且涉及EBV感染相關(guān)的62個lncRNA反式調(diào)控基因。LINC00312也稱為鼻咽癌相關(guān)基因7，具有抑癌基因的作用。LINC00312與鼻咽癌中由EBV轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA EBER-1呈高度負(fù)相關(guān)。LINC00312可以限制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，并阻止其在細(xì)胞周期中從G1期發(fā)展到S期，從而加劇細(xì)胞凋亡。LINC00312的表達(dá)與鼻咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[16]。以上結(jié)果表明，EBV調(diào)控的宿主lncRNA在鼻咽癌中起重要作用。Wang等[17]在EBVaGC研究中也發(fā)現(xiàn)，EBV感染可導(dǎo)致宿主lncRNA表達(dá)失控。本課題組前期分析表明，小核仁RNA宿主基因8(small nucleolar RNA host gene 8, SNHG8)在EBVaGC的表達(dá)明顯高于在非癌性胃黏膜細(xì)胞或EBV陰性胃癌組織中的表達(dá)。EBVaGC中SNHG8的表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)[7]。進(jìn)一步研究表明，SNHG8與EBV基因相互作用，包括BHLF1、LF3、BHRF1和BNLF2a。Huang等[7]推測SNHG8可以調(diào)節(jié)TRIM28、EIF4A2、NAP1L1、PLD3、RPL18A和TRPM7的表達(dá)，可能對胃癌的發(fā)生有直接影響。RNU12是本課題組篩選的另一個與EBVaGC相關(guān)的長鏈非編碼RNA。

RNU12在疾病及腫瘤中作用僅有少量文獻(xiàn)報道。RNU12基因突變引起早發(fā)性小腦共濟(jì)失調(diào)[18]。肝癌中研究發(fā)現(xiàn)RNU12可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控HSP72表達(dá)，進(jìn)而抑制重組人TRAIL蛋白誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。本組在前期工作和分析的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討RNU12在EBVaGC中的作用。EBVaGC中RNU12在癌與癌旁組織表達(dá)差異有顯著性(P<0.05)，且RNU12異常表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度密切相關(guān)。Kaplan-Meier分析RNU12表達(dá)與EBVaGC患者預(yù)后，結(jié)果顯示：RNU12低表達(dá)組患者總生存率比高表達(dá)組患者預(yù)后差(P=0.008)。以上結(jié)果表明，RNU12在EBVaGC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，RNU12的表達(dá)水平與EBVaGC臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。EBVaGC是胃癌的特殊類型，其形態(tài)學(xué)特征及基因變化與其他類型的胃癌有差異，目前相關(guān)分析仍較少。本課題組將積累更多病例進(jìn)行功能和機(jī)制分析，明確RNU12在EBVaGC的作用，為治療、控制和預(yù)防EBVaGC提供參考。