杜春平，曾麗霞，陳志寧，陳肖瑜，林思彤，駱成飄，馬 韻

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，包含多種病理組織學類型，其中甲狀癌乳頭狀癌是最常見的類型[1-2]。甲狀腺癌分子機制的分析，能夠推動其診療技術(shù)的發(fā)展[3-4]。酪氨酸硫酸化轉(zhuǎn)移酶1(tyrosylprotein sulfotransferase 1, TPST1)主要負責催化細胞內(nèi)酪氨酸硫酸化。研究發(fā)現(xiàn)TPST1在部分癌組織中表達下調(diào)，并與臨床病理特征相關(guān)[5]。TPST1與甲狀腺癌關(guān)系尚不明確。本實驗通過多個甲狀腺乳頭狀癌研究隊列的大數(shù)據(jù)和免疫組化檢測，分析TPST1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達、臨床及其分子意義，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源甲狀腺乳頭狀癌隊列分別來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA隊列；基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE27155、GSE3467和GSE6004隊列。THCA隊列的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)包含572例樣本(腫瘤組513例、對照組59例)。GSE27155、GSE3467和GSE6004隊列的基因表達芯片數(shù)據(jù)分別包含55例(腫瘤組51例、對照組4例)、18例(腫瘤組9例、對照組9例)和18例(腫瘤組14例、對照組4例)樣本。

1.2 數(shù)據(jù)分析UCSC Xena軟件(https://xenabrowser.net)分析TPST1 mRNA在THCA隊列中的表達。GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析TPST1 mRNA在GSE27155、GSE3467和GSE6004隊列中的表達。R軟件(https://www.r-project.org)分析THCA隊列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選與TPST1相關(guān)的差異表達基因。R軟件對差異基因進行基因本體論(Gene ontology, GO)富集分析。

1.3 免疫組化收集2020年1～4月廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院16例甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常組織。TPST1多克隆抗體購自Origene公司。免疫組化采用EnVision法染色，具體操作步驟及評分方法詳見文獻[6]。本實驗經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，患者均簽署知情同意書。

1.4 統(tǒng)計學分析采用R軟件進行統(tǒng)計學分析。秩和檢驗分析TPST1 mRNA的差異表達，并用中位數(shù)表示。TPST1蛋白的差異表達采用t檢驗，并用平均數(shù)表示。以TPST1 mRNA中位數(shù)為參照，低于中位數(shù)為低表達組，高于中位數(shù)為高表達組。兩者的相關(guān)性采用χ2和r檢驗。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較TPST1低、高表達組間的預后。Pearson相關(guān)檢驗篩選TPST1的差異表達基因，篩選標準為：P<0.05，r>0.4或<-0.4。

2 結(jié)果

2.1 各甲狀腺組織中TPST1 mRNA的表達應用4個甲狀腺乳頭狀癌隊列分析587例甲狀腺乳頭狀癌組織和76例對照組織，分析TPST1 mRNA的差異表達。與對照組相比(THCA隊列：8.610；GSE27155隊列：2.968；GSE3467隊列：8.142；GSE6004隊列：9.869)，TPST1 mRNA在THCA隊列(7.883，P<0.001)、GSE27155隊列(2.717，P=0.005)、GSE3467隊列(7.393，P=0.008)和GSE6004隊列(9.217，P=0.012)的癌組織中均表達顯著下調(diào)(圖1)。

圖1 TPST1 mRNA的表達：THCA(A)、GSE27155(B)、GSE3467(C)和GSE6004(D)隊列中，比較TPST1 mRNA在正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌組織的表達

2.2 甲狀腺癌中TPST1 mRNA表達與臨床病理特征及預后的關(guān)系本實驗分析THCA隊列中有504例甲狀腺癌中TPST1 mRNA與臨床病理特征及預后的關(guān)系，結(jié)果顯示：TPST1 mRNA與病理分期(P=0.029，r=-0.10)、T分期(P<0.001，r=-0.215)、N分期(P<0.001，r=-0.213，表1)等呈負相關(guān)。TPST1 mRNA高表達組的無瘤生存期(P=0.003)和無進展生存期(P=0.009)顯著高于低表達組；但總生存率(P=0.261)和疾病特異生存率(P=0.156)差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 TPST1 mRNA與甲狀腺乳頭狀癌患者的預后分析：A無瘤生存期；B.無進展生存期

表1 甲狀腺乳頭狀癌中TPST1 mRNA與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 甲狀腺癌中TPST1蛋白的表達免疫組化檢測TPST1蛋白在16例甲狀腺乳頭狀癌組織和16例對照組織中的表達，結(jié)果顯示：TPST1主要定位于細胞質(zhì)，TPST1在甲狀腺乳頭狀癌組(2.000±0.2415)中的表達顯著低于對照組(2.813±0.2918，P=0.040，圖3、4)。

圖3 TPST1蛋白在組織中的表達，EnVision法：A.正常甲狀腺組織；B.甲狀腺乳頭狀癌組織

2.4 TPST1共表達基因及其功能生物信息學分析篩選TPST1共表達基因976個，其中呈正相關(guān)有MAGEH1、FHL1和TIMP3等686個基因(P<0.05，r>0.40)，呈負相關(guān)有CDK16、FN1和MET等290個(P<0.05，r<-0.4)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的分子功能主要是蛋白酶結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合參與細胞與細胞的黏附、細胞黏附分子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等。參與的生物學過程主要是MAP激酶活性的調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控、調(diào)節(jié)GTPase的活性等。

3 討論

本實驗應用4個獨立的甲狀腺乳頭狀癌隊列合計663例樣本，比較TPST1在正常組織和腫瘤組織中的表達水平。大樣本和多隊列充分論證TPST1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中表達顯著下調(diào)。免疫組化也證實TPST1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達下調(diào)。TPST1可能是甲狀腺乳頭狀癌的潛在標志物。另外，TPST1與病理分期、T分期和N分期等呈負相關(guān)，提示其表達下調(diào)，可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展有關(guān)。最后TPST1高表達組患者的無瘤生存期和無進展生存期顯著高于低表達組，提示TPST1表達水平與患者預后有關(guān)，與Jiang等[5]在肺癌中的分析一致。本實驗提示TPST1基因表達下調(diào)，可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展和預后有關(guān)。

圖4 TPST1蛋白在不同組織中表達的統(tǒng)計學分析

本組為揭示TPST1在甲狀腺乳頭狀癌的中潛在分子機制，生物信息學篩選976個與TPST1相關(guān)的差異表達基因，這些基因中MAGEH1與細胞凋亡、周期阻滯和生長抑制有關(guān)，其表達下調(diào)可促進肝癌的進展[7]。FHL1是腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[8]。TIMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。CDK16在多種腫瘤中高表達，可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖、遷移、侵襲、凋亡[10]。FN1能促進甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲[11]。MET在多種腫瘤中過表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有關(guān)[12]。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，TPST1與血管內(nèi)皮生長因子信號通路、細胞的黏附等生物學功能有關(guān)。因此，TPST1可能與上述基因和生物功能共同影響甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物行為，還有待于進一步分析。

總之，本實驗結(jié)果顯示TPST1對甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展可能具有一定的影響，有望成為甲狀腺乳頭狀癌診斷和預后的標志物。