郭治偉

絕大多數(shù)機會性真菌病通常是由組成正常人類微生物群的病原體(如念珠菌和曲霉)引起的,因其在自然界的普遍性使其很容易獲得免疫受損宿主［1,2］。老年人通常長期使用廣譜抗菌藥物或激素,這可能巧合導(dǎo)致宿主體內(nèi)微生物菌群失調(diào),也可能直接干擾宿主的免疫狀態(tài),嚴(yán)重減弱宿主免疫系統(tǒng)的效力。此外人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、腫瘤化療或干細(xì)胞移植等因素都能導(dǎo)致條件性真菌感染增高。當(dāng)宿主的免疫反應(yīng)受損慘重時,體內(nèi)這些生物體會從無害的共生體轉(zhuǎn)變成侵入性病原體［3］,而且這些機會性真菌通常會引起嚴(yán)重的感染。為了及時準(zhǔn)確找到侵入的病原體,幫助臨床醫(yī)生明確患者診斷,指導(dǎo)臨床合理選藥和用藥,必須要選用恰當(dāng)?shù)臋z測方法,提高真菌的檢出率。本研究對呼吸道深部真菌感染4 種檢測方法的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析,探索最佳的檢測方法和方案。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院呼吸科2019 年1 月～2020 年4 月收治的317 份疑為深部真菌感染患者的下呼吸道標(biāo)本,其中痰(清潔口腔后,自然深咳痰)96 份,氣管吸取物147 份和肺泡灌洗液74 份。痰和氣管吸取物的選取標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞＞25/低倍鏡視野,上皮細(xì)胞＜10/低倍鏡視野；白細(xì)胞＞25/低倍鏡視野,上皮細(xì)胞10～25/低倍鏡視野或白細(xì)胞10～25/低倍鏡視野,上皮細(xì)胞＜10/低倍鏡視野；排除不合格的送檢標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器 OLYMPUS 顯微鏡(帶有熒光模塊,波長：340～380 nm)、革蘭染色液(溫州市康泰生物科技有限公司)、Baso 真菌熒光染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、沙保羅瓊脂培養(yǎng)基(溫州市康泰生物科技有限公司)、兩個恒溫培養(yǎng)箱、10%氫氧化鉀(KOH)溶液。

1.3 方法 將每份標(biāo)本隨機分為4 份,分別用于真菌培養(yǎng)法、10%KOH 濕片法、革蘭染色法和熒光染色法檢測。

1.3.1 真菌培養(yǎng) 用無菌拭子沾取適量的下呼吸道標(biāo)本(肺泡灌洗液離心后,用移液槍吸取適量沉淀標(biāo)本),用平板劃線法把每份標(biāo)本同時接種至2 個沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上,然后分別放置在28℃和35℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 周,每天觀察生長情況,若有菌落形成,通過菌落特征及顯微鏡下特征確認(rèn)后則可以判定為陽性。如果沒有菌落生長則持續(xù)觀察,最長培養(yǎng)至2 周,若仍無菌落生長,則判定為陰性。

1.3.2 10%KOH 濕片法 取適量標(biāo)本置于載玻片上,滴加1 滴10%KOH 溶液,覆蓋上蓋玻片,并在酒精燈火焰上快速通過2～3 次(保證不要沸騰),輕壓蓋玻片,用無菌棉簽吸去邊緣溢出的多余液體,先用低倍鏡找到樣本所在位置,再用高倍鏡觀察菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)。若高倍鏡下觀察到真菌菌絲或孢子則判定為陽性。如果高倍鏡下未找到真菌菌絲或孢子則判定為陰性。

1.3.3 革蘭染色 先取適量的標(biāo)本涂片(肺泡灌洗液離心后,再取適量沉淀標(biāo)本涂片),然后經(jīng)過自然晾干和固定,再進(jìn)行革蘭染色,若油鏡下觀察到紫色的菌絲或孢子則判定為陽性。如果未發(fā)現(xiàn)紫色的菌絲或孢子則判定為陰性。

1.3.4 熒光染色 取適量標(biāo)本涂抹(肺泡灌洗液離心后,再取適量沉淀標(biāo)本涂抹)載玻片上,然后在標(biāo)本上滴加1 滴熒光染色液并蓋上蓋玻片,輕壓蓋玻片,用棉簽吸去邊緣溢出的多余染色液后,先用低倍鏡找到樣本所在位置,再用高倍鏡觀察發(fā)出明亮熒光的菌絲或孢子等結(jié)構(gòu)。若高倍鏡下觀察到亮藍(lán)色真菌菌絲或孢子則判定為陽性。如果未找到亮藍(lán)色真菌菌絲或孢子則判定為陰性。

1.4 觀察指標(biāo) 對比真菌培養(yǎng)法、10%KOH 濕片法、革蘭染色法和熒光染色法的檢測結(jié)果,分別比較其檢測的陽性率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

下呼吸道317 份標(biāo)本檢測的陽性率顯示,熒光染色法檢測陽性率為89.3%(283 例陽性),革蘭染色法檢測陽性率為76.0%(241 例陽性),真菌培養(yǎng)法檢測陽性率為73.8%(234 例陽性),10%KOH 濕片法檢測陽性率為63.4%(201 例陽性)。熒光染色法檢測陽性率高于革蘭染色法、真菌培養(yǎng)法、10%KOH 濕片法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。革蘭染色法檢測陽性率與真菌培養(yǎng)法比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。革蘭染色法、真菌培養(yǎng)法檢測陽性率均高于10%KOH 濕片法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同標(biāo)本類型4 種檢測方法的檢測結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

真菌感染可用多種方法進(jìn)行診斷,通過培養(yǎng)檢測法最為準(zhǔn)確［4］。雖然培養(yǎng)檢測法耗時長,限制了真菌感染的早期診斷和治療,而且檢測陽性率不如染色法高,但要獲得藥敏結(jié)果就必須做真菌培養(yǎng)。精準(zhǔn)的選藥同樣依賴于菌種的正確鑒定,然而念珠菌或絲狀真菌無論是用生化反應(yīng)鑒定、質(zhì)譜鑒定還是形態(tài)學(xué)鑒定,都需要先通過培養(yǎng)長出真菌菌落?？梢傻恼婢腥?臨床送檢真菌培養(yǎng)對診斷和治療是非常有必要的。

通過本研究結(jié)果顯示,熒光染色法檢測陽性率高于革蘭染色法、真菌培養(yǎng)法、10%KOH 濕片法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。熒光染色法檢測陽性率最高,有重要的參考價值。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道［5］,熒光染色法在患者已經(jīng)用藥、標(biāo)本量很少等情況下依然有較高的檢測陽性率。對于真菌培養(yǎng)陰性,而熒光染色陽性的標(biāo)本,可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時間或重新增加接種量進(jìn)行再次培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)聯(lián)合熒光染色可提高臨床標(biāo)本中真菌的檢出率,為臨床診斷及合理用藥提供指導(dǎo)。

革蘭染色檢測法明顯不如熒光染色檢測法敏感,且革蘭染色液的染料雜質(zhì)容易被誤判為真菌,對檢測人員技術(shù)要求也較高,可以因主觀因素造成誤差。革蘭染色的優(yōu)勢是染液價格便宜,操作簡單,各實驗室都可以常規(guī)開展。革蘭染色法也可以聯(lián)合培養(yǎng)法,提高病原體檢出率,輔助真菌感染患者的臨床診斷和治療［6］。

實踐證明熒光染色也可以在20 倍鏡下觀察,同樣能找到染色后的菌絲,不僅可以避免在低倍鏡下觀察時漏檢,也比高倍鏡觀察節(jié)省時間。熒光染色法只需要極短時間即可完成檢驗,比其他方法檢測時間短。

10%KOH 濕片法可以較好的溶解組織細(xì)胞,使組織透明化,操作簡單、快速且經(jīng)濟(jì),但由于標(biāo)本中雜質(zhì)多而導(dǎo)致背景雜亂,對檢測人員的技術(shù)水平要求比較高。本研究顯示,革蘭染色法、真菌培養(yǎng)法檢測陽性率均高于10%KOH 濕片法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與相關(guān)研究結(jié)論相同［7］。據(jù)有關(guān)研究［8］表明,10%KOH 濕片法也可用于皮屑、甲屑和毛發(fā)的檢驗,但個人主觀因素影響較大,假陽性常因為把纖維或細(xì)胞壁誤當(dāng)作菌絲以及把油滴或氣泡誤判為孢子；同時也比較容易漏檢散在的孢子或菌絲,造成假陰性。

熒光染色由于染液成本較高,而且需要配套的熒光顯微鏡,所以至今未能廣泛常規(guī)開展。真菌熒光染色劑中,經(jīng)過特殊熒光素標(biāo)記的重組幾丁質(zhì)酶可以高親和力與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)或β-葡聚糖結(jié)合,反應(yīng)靈敏且抗干擾強,在熒光顯微鏡高倍視野下,真菌菌絲和孢子發(fā)出明亮的熒光,清晰的圖像可顯著提高辨識度［9］。熒光染色不僅操作方便快捷,而且對檢測人員的技術(shù)水平要求不高,可彌補技術(shù)人員經(jīng)驗的不足,減少操作者的主觀判斷帶來的誤差和檢查結(jié)果假陰性的發(fā)生,進(jìn)而可以有效降低漏檢率。熒光染色可用于各類真菌的檢測,包括念珠菌、曲霉菌、馬爾尼菲青霉菌、組織胞漿菌、毛霉、隱球菌和肺胞子菌；這些真菌細(xì)胞壁都能與染料很好的結(jié)合而發(fā)出熒光。開展熒光染色可大大提高真菌檢測的效率和準(zhǔn)確率,在條件允許的情況下建議廣泛開展。

已有文獻(xiàn)證明［10-12］,熒光染色還可用于陰道分泌物、毛發(fā)、尿液、胸水其他體液、糞便、皮膚組織和甲屑的真菌檢測,且優(yōu)于革蘭染色和真菌培養(yǎng)法。角蛋白、膠原蛋白和彈性纖維也能使用本試劑盒進(jìn)行檢測。希望未來會研究出比較低廉的熒光染色劑,廣泛推廣于實驗室,提高真菌的檢出率。

綜上所述,熒光染色是一種快速有效的呼吸道標(biāo)本的真菌檢測方法,聯(lián)合真菌培養(yǎng)可提高呼吸道標(biāo)本真菌檢出率,更好的輔助臨床診斷和治療。