時云朵，孫 豪

（1.四川省水產(chǎn)學校，成都 611730；2.雅安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 雅安 625000）

大熊貓是中國特有珍貴野生動物，有“國寶”和“活化石”之稱，被譽為野生動物保護領域的“旗艦物種”。自1869年定為新種后，便對大熊貓進行了多學科的研究，對其腸道菌群的研究可以追溯到20 世紀80 年代[1]。研究表明，腸道微生物對大熊貓消化吸收、代謝免疫和疾病等具有重要意義[2]。大熊貓本身不能分泌纖維素酶，其消化纖維素的功能主要由腸道微生物來完成[3]。此外，大熊貓腸道疾病被認為是其死亡的最重要原因之一，腸道微生態(tài)的改變可引起大熊貓消化功能紊亂甚至疾病[4]。因此，研究大熊貓腸道菌群及其生物學特性是篩選大熊貓益生菌的重要基礎，對科學防治大熊貓腸道疾病、保護大熊貓種群具有重要意義。本文就大熊貓腸道菌群結構及其生物學特性進行綜述。

1 大熊貓腸道菌群結構

以竹類為主食的大熊貓腸道卻很短，沒有瘤胃供食物發(fā)酵，且沒有盲腸，類似肉食動物的消化道結構；且其腸道菌群與其他草食動物的腸道菌群大有不同，但類似熊的腸道微生態(tài)群[5]。這種類似肉食動物的消化道結構、熊樣的腸道微生態(tài)以及類似草食動物的飲食特性決定了大熊貓擁有一個獨特的腸道微生態(tài)。隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，對大熊貓腸道菌群有了更深層次的了解。

1.1 分離鑒定方法研究大熊貓腸道菌群結構

分離鑒定方法是早期研究大熊貓腸道菌群的主要方法。Hirayama等采用分離鑒定方法對大熊貓的糞便菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)成年大熊貓的糞便菌群以鏈球菌和腸桿菌科細菌為主，專性厭氧菌較少，截然不同于其他動物；哺乳期的大熊貓糞便的優(yōu)勢菌是乳酸桿菌和鏈球菌，其次是雙歧桿菌，但隨著開始吃竹葉，糞便中乳酸菌數(shù)量減少，雙歧桿菌逐漸消失，而腸桿菌科成為最主要的菌群之一；此外，雌性和雄性大熊貓糞便中優(yōu)勢菌群（鏈球菌）的種不同，提示不同性別的大熊貓糞便菌群存在區(qū)別[1]。彭真信等對3只健康大熊貓和1 只患慢性胃腸炎的大熊貓糞便菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)4只大熊貓糞便中均未檢出雙歧桿菌，認為此菌不宜做大熊貓微生態(tài)制劑，且健康大熊貓糞便中優(yōu)勢菌群為大腸埃希菌和真桿菌，而在患病大熊貓糞便菌群中上述兩類菌群明顯偏高，認為大熊貓腸道慢性疾病可能與腸道菌群失調(diào)有關[6]。陳希文等對大熊貓腸道內(nèi)容物的致病菌進行了選擇培養(yǎng)，分離到19 株菌，其中優(yōu)勢菌為大腸埃希氏菌[4]。熊焰等對6只不同年齡的大熊貓全年糞便菌群進行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)不同年齡段大熊貓的糞便菌群數(shù)量存在差異，且分離鑒定出16 種細菌，優(yōu)勢菌群為腸球菌、腸桿菌和乳桿菌，均為好氧菌和兼性厭氧菌[7]。周杰瓏等對3只成年大熊貓的春季晝間糞便中可培養(yǎng)微生物進行細菌學鑒定，分離12株細菌，鑒定歸為6屬8種，其中優(yōu)勢菌是大腸桿菌和芽孢桿菌屬[8]。分離鑒定方法雖在初步了解大熊貓腸道菌群結構和篩選大熊貓源益生菌中起到了非常重要的作用，但由于方法的局限性，結果可能存在較大誤差。

1.2 分子鑒定方法研究大熊貓腸道菌群結構

分子鑒定方法是基于16SrDNA 擴增菌群核酸序列，最終以圖譜形式進行展示、比較分析等反映菌群結構。魯海峰等采用ERIC-PCR技術對3只大熊貓糞便菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)不同個體間的糞便菌群結構比較相似，且同一個體在不同時期菌群結構穩(wěn)定性較高[9]。Wei 等采用PCR-TGGE 技術對3 只大熊貓糞便菌群多樣性、優(yōu)勢菌群及其動態(tài)變化進行分析，發(fā)現(xiàn)3 只大熊貓糞便菌群多樣性高度相似，且兩年間相對穩(wěn)定，革蘭氏陰性菌、兼性菌占到克隆庫的60%[10]。王曉艷等通過16SrDNA-EFLP 及測序分析構建了3 只圈養(yǎng)老年大熊貓糞便細菌16SrDNA 克隆文庫，發(fā)現(xiàn)其糞便菌群主要由變形菌門和厚壁菌門細菌組成，變形菌門中以大腸埃希氏菌屬為主，厚壁菌門中以鏈球菌屬為主，并發(fā)現(xiàn)一定比例的未培養(yǎng)細菌[11]。Peng等采用PCR-DGGE 技術和優(yōu)勢條帶克隆測序方法對12 只（亞成年、成年和老年各4 只）圈養(yǎng)大熊貓糞便菌群的多樣性、優(yōu)勢菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)成年大熊貓糞便菌群多樣性顯著高于老年大熊貓，厚壁菌門和變形菌門細菌為優(yōu)勢菌群；并通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)，成年大熊貓糞便中乳酸菌豐度顯著高于其余年齡段大熊貓，且均未檢出雙歧桿菌[12]。由于大熊貓的特殊性，其糞便樣品在研究其腸道菌群中扮演重要角色。Zhu等通過PCR技術分析了大熊貓糞便樣品存儲保護劑、儲存時間等因素對微衛(wèi)星實驗的影響，結果發(fā)現(xiàn)直接冷凍的大熊貓糞便樣品不宜用于微衛(wèi)星實驗，應選擇含有乙醇等保護劑的樣品[13]。為進一步探索大熊貓腸道菌群，賴婧等采用PCR-DGGE 技術對比分析了偽無菌小鼠（口服抗生素處理后的小鼠）定植大熊貓糞便菌群后的腸道菌群結構與大熊貓糞便菌群結構，初步建立了符合大熊貓腸道菌群特征的小鼠模型[14]。分子鑒定方法研究大熊貓腸道菌群，可以更快速、更多地檢出一些現(xiàn)行條件下不能培養(yǎng)的細菌，進一步加深了對大熊貓腸道菌群結構的了解，但不能較全面的量化反映菌群結構及代謝關系等。

1.3 高通量測序方法研究大熊貓腸道菌群結構

近年來，隨著二代測序技術的迅猛發(fā)展，高通量測序方法被廣泛用于大熊貓腸道菌群研究中，使得對其腸道菌群有了更深入的了解。王立志等發(fā)現(xiàn)，大熊貓糞便菌群主要由變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和藍藻門色球藻綱組成，變形菌門以埃希氏桿菌屬/志賀氏菌屬為主，厚壁菌門以梭菌屬為主，擬桿菌門以穩(wěn)桿菌屬為主[15]。劉燕等比較分析了3只大熊貓（14、16月齡）的糞便菌群多樣性及差異，發(fā)現(xiàn)14 月齡大熊貓的糞便菌群中乳球菌屬比例高于16 月齡[16]。何永果等發(fā)現(xiàn)，與亞健康大熊貓比較，健康大熊貓糞便菌群中埃希菌屬、梭菌屬高，鏈球菌屬低，菌群多樣性為成年＞老年＞亞成體，認為健康狀況和年齡對成年大熊貓糞便菌群結構影響較大[17]。晉蕾等發(fā)現(xiàn)，在大熊貓“培訓→放歸→野外”的過程中，其糞便細菌菌群豐富度和多樣性差異不大，而真菌菌群的豐富度差異較大，認為大熊貓預放歸過程腸道菌群不穩(wěn)定，建議縮短預放歸時間[18]。詹明曄等發(fā)現(xiàn)，上海市成體大熊貓糞便菌群多樣性較四川省的更加豐富，兩地成體大熊貓糞便優(yōu)勢菌群和特異菌群差異較大，且上海的有較高的芽孢桿菌屬及山野殼菌科未知菌屬[19]。Zhu 等發(fā)現(xiàn)，大熊貓糞便微生物組的物種豐度低于其他草食和肉食哺乳動物，其糞便菌群中具有編碼纖維素酶等基因的梭菌綱菌群比例較高[20]。此外，Zhu 等對大熊貓、小熊貓、鹿等動物的腸道微生物基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道中有較高比例的假單胞菌，認為大熊貓腸糞便菌群還有較強的氰化物降解作用[21]。高通量測序技術使人們對大熊貓腸道菌群及其生物學特性有了更深層次的了解，但菌群間、菌群與宿主間的相互作用機制，需要多學科、多組學進一步研究。

2 大熊貓腸道菌群的生物學特性

大熊貓腸道菌群的生物學特性主要是針對大熊貓源微生物的生物學特性研究，包括纖維素降解特性、益生特性和耐藥性等方面，高通量測序方法從基因水平上了解腸道菌群對大熊貓消化、疾病等的影響。

2.1 大熊貓腸道菌群的纖維分解特性

以竹為主食的大熊貓是探討微生物降解纖維素的重要研究對象，近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)大熊貓糞便菌群具有纖維素降解能力。Zhu等發(fā)現(xiàn)，大熊貓本身的寡糖降解酶豐度與人類接近，纖維素酶和半纖維素酶豐度很低，而其糞便菌群中有纖維素降解作用的梭菌綱菌群比例較高，宏基因組進一步分析，發(fā)現(xiàn)糞便菌群含有編碼纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、1,4-β-木糖苷酶木聚糖及1,4-β-木聚糖酶的相關基因，認為大熊貓腸道菌群在機體纖維素代謝中具有重要作用[20]。詹明曄等發(fā)現(xiàn)，與四川省相比，上海市成體大熊貓糞便菌群中含有更高比例的芽孢桿菌屬和山野殼菌科未知菌屬，且有更高的纖維素消化能力，認為不同地區(qū)成體大熊貓糞便微生物結構差異明顯，對機體消化能力有一定的影響[19]。王海娟等歸納了大熊貓降解纖維素的初步機制，認為大熊貓腸道中的假單胞菌分泌的漆酶將竹纖維中的木質(zhì)素氧化，暴露出纖維素，梭菌屬、淀粉芽胞桿菌等分泌的纖維素酶將其降解為大熊貓可利用的糖類[3]。與之相反，Zhang等發(fā)現(xiàn)，大熊貓腸道菌群中含有較低豐度的木質(zhì)素和纖維素降解編碼基因，而淀粉和半纖維素降解編碼基因豐度較高，認為大熊貓腸道菌群對纖維素和木質(zhì)素的降解作用幫助不大，主要降解半纖維素[22]。Xue等發(fā)現(xiàn)，大熊貓腸道菌群與肉食性動物相似，認為以竹類食物為主的大熊貓似乎還未進化出符合高纖維飲食的腸道菌群[23]。Wei等通過宏基因組序列對比分析了大熊貓、肉食動物、草食動物及雜食動物的腸道菌群基因序列相關數(shù)據(jù)，也發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道菌群功能與熊和肉食動物的更為相似，且纖維素、半纖維素消化酶基因豐度與肉食動物相似；通過體外酶活實驗分析，發(fā)現(xiàn)大熊貓糞便中纖維素酶和木聚糖酶活性在食草動物中最低，認為大熊貓腸道菌群并不能高效降解竹中的纖維素和半纖維素[5]。因此，大熊貓腸道菌群對纖維素等的降解能力有待進一步研究。

2.2 大熊貓源候選益生菌的益生特性

篩選大熊貓源益生菌是研究大熊貓腸道菌群的一個重要方向，近年來，大量研究報道了大熊貓源益生菌的益生特性。王強等發(fā)現(xiàn)，從正常大熊貓糞便中篩選出的乳桿菌對大熊貓腹瀉、腸炎、營養(yǎng)不良等疾病療效顯著，填補了大熊貓專用微生態(tài)制劑的空白[24]。在這之后，有研究者也從大熊貓糞便中分離獲得植物乳桿菌，體外實驗發(fā)現(xiàn)其在低pH 和高膽鹽濃度下具有良好的穩(wěn)定性，對腸毒素大腸桿菌K88的抗性較強，且對抗生素敏感[25]。小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其能抑制腸毒素大腸桿菌K88入侵小鼠腸道、改善腸道菌群結構，認為該菌可作為大熊貓源益生菌的候選菌株[26]。Zhou等分離一批大熊貓源芽孢桿菌屬菌株，體外實驗發(fā)現(xiàn)其均能抑制腸道致病菌，通過抗菌基因檢測發(fā)現(xiàn)該批芽孢桿菌每菌株至少含有兩種常見抗菌基因，認為芽孢桿菌的抗菌能力可能是大熊貓維持腸道菌群平衡的機制之一[27]。Zhou等也分離了一株大熊貓源枯草芽孢桿菌，該菌具有纖維素分解能力，能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，且此抗菌活性不隨溫度、pH、胰蛋白酶和胃蛋白酶濃度變化而變化，認為該菌有利于草食動物的腸道健康[28]。另外，Xiong 等分離了一株大熊貓源融合魏斯氏菌，體外實驗發(fā)現(xiàn)該菌能在pH為2和0.3%（w/v）濃度的膽汁鹽環(huán)境下存活，且能抑制常見的腸道病原體，認為該菌可作為大熊貓源侯選益生菌株[29]。從上述研究中發(fā)現(xiàn)，目前大熊貓源益生菌主要有乳酸桿菌、芽孢桿菌和魏斯氏菌3種，應用于大熊貓的只有一株乳酸桿菌。同時，對候選益生菌的研究大多停留在體外實驗，體內(nèi)實驗較少，還未見有單菌測序分析的相關報道。

此外，耐藥性也是大熊貓腸道菌群研究的一個關注重點。有研究發(fā)現(xiàn)大熊貓源大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑林、四環(huán)素和復方新諾明等有較高耐藥性，Ⅰ型整合酶基因在大腸桿菌中廣泛存在，表明大熊貓腸道菌群的耐藥性比較嚴峻，提示大熊貓疾病預防中要防止抗生素濫用，且應將耐藥性作為大熊貓源益生菌篩選的指標之一[30]。

3 小 結

大熊貓獨特胃腸道結構和飲食習性決定了其擁有一個獨特的腸道菌群。目前已初步認識了大熊貓腸道菌群的基本構成，發(fā)現(xiàn)用藥、年齡、季節(jié)、生活環(huán)境等因素可引起腸道菌群變化，并分離了部分益生特性較好的大熊貓源候選益生菌株，然而菌群間、菌群與宿主間的相互作用機制，菌群對纖維素等的降解能力及機制，以及腸道中真菌、古細菌、病毒等微生物的研究，均需多學科、多組學進一步研究[31-35]。此外，還應創(chuàng)新微生物培養(yǎng)方式，為獲得更多大熊貓源益生菌，促進大熊貓微生態(tài)制劑臨床應用創(chuàng)造條件。