陳 超，吳惠勤，黃曉蘭，黃 芳，劉夢云

(廣東省科學院 廣東省測試分析研究所(中國廣州分析測試中心) 廣東省中藥質(zhì)量安全 工程技術研究中心，廣東 廣州 510070)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪甲苷即黃芪皂苷Ⅳ，因具有抑制結腸癌細胞增殖、抗糖尿病、抗炎等多種藥理活性[2-4]，自1995年版《中華人民共和國藥典》開始被作為黃芪藥材質(zhì)量控制的重要指標之一。

2015年版《中華人民共和國藥典》[1](以下簡稱《中國藥典》)中黃芪含量測定項下，樣品采用索氏提取，提取液蒸干后用正丁醇萃取和氨試液除雜，正丁醇層蒸干后再利用D101大孔樹脂純化，純化后的溶液蒸干后定容，利用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器(HPLC-ELSD)測定黃芪皂苷Ⅳ含量。與《中國藥典》相比，《香港中藥材標準》[5](以下簡稱《港標》)對黃芪皂苷Ⅳ的測定方法更為簡便，采用甲醇超聲提取，用氨試液溶解提取物后再用水飽和的正丁醇萃取，測得的黃芪皂苷Ⅳ含量與《中國藥典》法測得的含量無顯著性差異[6-7]。《中國藥典》和《港標》對黃芪藥材中黃芪皂苷Ⅳ含量測定的前處理過程中均使用氨試液，但堿性溶液在去除黃酮等酚酸類物質(zhì)的同時，會引起其他皂苷類成分脫掉乙?；虮；鵞8]而轉(zhuǎn)化為黃芪皂苷Ⅳ，如黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黃芪皂苷Ⅰ等[9]；不同的堿處理方法和處理時間的長短均會影響黃芪皂苷Ⅳ的得率[10-11]?！吨袊幍洹泛汀陡蹣恕窚y得的黃芪皂苷Ⅳ含量并不是黃芪藥材中原始的含量，而是包含了其他黃芪皂苷類成分在堿性溶液中水解后的含量。由于氨試液振搖時間和振搖后放置時間均未明確規(guī)定，在實驗過程中因檢測人員操作的差異性，導致黃芪皂苷Ⅳ同系物水解不完全，使得黃芪皂苷Ⅳ的重復性不佳[12]，影響了對藥材進行準確的質(zhì)量評價。

目前，關于黃芪藥材中黃芪皂苷Ⅳ含量測定的方法主要有薄層掃描法、分光光度法、近紅外光譜法和HPLC法，其中HPLC-ELSD法最為常見。黃艷偉等[13]采用加速溶劑萃取法(ASE)減少了溶劑用量和提取時間，王玉等[14]采用Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化了黃芪藥材提取工藝中的乙醇濃度、提取時間和提取次數(shù)，這些文獻中關于黃芪皂苷Ⅳ的凈化過程均采用《中國藥典》方法。此外，有文獻[15]采用在線固相萃取(SPE)-液相色譜法結合電霧式檢測器(CAD)，將黃芪藥材用0.1 mol/L 氫氧化鉀-甲醇提取后，直接用其特有的裝置進行含量測定，自動化程度高，確保了黃芪皂苷Ⅳ的提取率和重現(xiàn)性，但使用SPE柱加大了檢測成本。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法具有高靈敏度和選擇性，可以簡化樣品前處理過程，提高分析效率，適用于復雜樣品中微量成分的檢測。夏義平等[16]用堿性溶液提取藥材，調(diào)至中性后直接采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定黃芪中黃芪皂苷Ⅳ的含量，測定結果包含了轉(zhuǎn)化后的黃芪皂苷Ⅳ。

本文采用UPLC-MS/MS法考察了不同提取方式和凈化操作對黃芪藥材中游離黃芪皂苷Ⅳ提取率的影響，并利用具有超高分辨率的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICR-MS)分析其相關成分的差異性。本研究還闡明了4種黃芪皂苷Ⅳ同系物之間的轉(zhuǎn)化途徑，確定了導致《中國藥典》測定結果不穩(wěn)定的原因，優(yōu)化了含量測定的方法，最終建立了一種穩(wěn)定、高效的黃芪藥材中游離黃芪皂苷Ⅳ含量測定方法，可為準確評價黃芪藥材質(zhì)量提供重要依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity Ⅱ UPLC/6470 QQQ 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；Agilent 1290 Infinity Ⅱ/Solarix 7.0 T 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(美國Agilent公司/德國Bruker公司)；AS 3120超聲波發(fā)生器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；FCE-3000索氏提取器(上海喬躍電子有限公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；D101型大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201717，含量：96.9%)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(LC-MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司)；實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

實驗所用黃芪藥材(Y1、Y2和Y3)均為客戶委托送檢樣品，產(chǎn)地為甘肅，經(jīng)專家鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao(Y1和Y2)或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.(Y3)的干燥根。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取黃芪皂苷Ⅳ對照品適量，加甲醇溶解并定容，得198 mg/L的標準儲備溶液；準確移取一定量標準儲備溶液，用甲醇配制質(zhì)量濃度為0.387 0、0.774 0、1.548、3.095、6.190、12.38、24.75 mg/L的系列標準工作液。

1.3 樣品前處理

將藥材粉碎后過四號篩(65目，國家標準R40/3系列)，精密稱取樣品粉末2 g，提取溶劑為甲醇，將直接提取后的溶液和提取后除雜的溶液過濾后，經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，外標法定量分析。

1.3.1 提取方式考察考察3種提取方式：A、將樣品粉末置于索氏提取器中，用甲醇冷浸過夜，索氏提取(85 ℃) 4 h，定容至100 mL；B、將樣品粉末置于索氏提取器中，用甲醇直接提取(85 ℃)5 h，定容至100 mL；C、超聲提取3次，每次加50 mL甲醇，提取時間分別為1、1、0.5 h，將提取液合并濃縮后定容至100 mL。按上述提取方式制備提取液，過濾后待測。

1.3.2 凈化過程考察選擇Y1樣品粉末按提取方式B進行提取，考察兩個提取溫度(85、95 ℃)，每個溫度做4個平行樣，提取溶液均定容至100 mL，取0.5 mL過濾后待測(溶液a)；剩余溶液蒸干后按《中國藥典》要求，殘渣加10 mL水，微熱使其溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，分別合并上層正丁醇液；分別將同一提取溫度下的2個平行樣，直接蒸干正丁醇層(溶液b)；剩余2個平行樣，將正丁醇層用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去下層氨液，正丁醇層蒸干(溶液c)；蒸干后(蒸干溫度為95 ℃)的平行樣，分別用甲醇定容至100 mL。

1.4 測定條件

色譜條件：色譜柱：Agilent HPH C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；進樣量：1 μL；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0～10 min，10%～32% B；10～15 min，32% B；15～20 min，32%～90% B；20～20.5 min，90%～10% B；20.5～22 min，10% B。

低分辨質(zhì)譜條件：AJS 電噴霧離子源(ESI)正離子模式；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；碎片電壓：120 V；碰撞能量：12 eV；檢測方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)；定量離子對：m/z785.6→143.2；定性離子對：m/z785.6→ 473.3。

高分辨質(zhì)譜條件：正或負離子模式；掃描范圍：m/z100～1 500；噴霧氣壓力：80 kPa；干燥氣流速：7 L/min；干燥氣溫度：250 ℃；毛細管入口電壓：4.0 kV；錐孔電壓：20 V；采樣大小為2 M(兆)；累積時間為0.1 s；儀器進樣前需用三氟乙酸鈉進行校準，數(shù)據(jù)采集后根據(jù)已知成分的精確分子質(zhì)量進行數(shù)據(jù)再校準，以確保質(zhì)譜數(shù)據(jù)的準確性。

2 結果與討論

2.1 不同提取方式的比較

表1 不同提取方式(直接測定提取液)下 游離黃芪皂苷Ⅳ的含量Table 1 Content of free astragaloside Ⅳ under different extraction methods(direct determination of the extracts)

李煥娟等[17]對比了本文中的3種提取方式，結果表明回流提取法測得的黃芪皂苷Ⅳ含量較高。但該文獻仍按照《中國藥典》方法，采用了正丁醇萃取和氨試液除雜過程。本研究選取3批黃芪藥材，按《中國藥典》方法測定黃芪皂苷Ⅳ的含量:Y1(含0.073%)和Y3(含0.081%)樣品合格，Y2(含0.019%)樣品不合格?？疾臁?.3.1”中3種提取方式對黃芪皂苷Ⅳ提取率的影響，采用“1.4”方法測定含量。由表1可知，按《中國藥典》方法提取純化后總黃芪皂苷Ⅳ含量是直接提取后游離黃芪皂苷Ⅳ含量的5～15倍。提取方式B測定的含量最高，說明浸泡過夜不影響提取率，而提取時間直接影響提取次數(shù)，提取次數(shù)才是影響提取率的關鍵因素。提取方式C測得的含量較低，說明超聲提取的提取率較低。相比之下，采用索氏提取法可避免繁瑣操作給定量分析帶來的誤差。因此，本研究確定最優(yōu)提取方法為方式B：采用索氏提取法，用甲醇于85 ℃提取5 h。

2.2 凈化過程的影響

按“1.3.2”對Y1樣品進行凈化過程的影響考察，結果顯示(見表2)，直接提取后(溶液a)和繼續(xù)用正丁醇萃取后(溶液b)黃芪皂苷Ⅳ的測定結果無顯著性差異，說明蒸干提取液、正丁醇萃取和蒸干正丁醇萃取液(不加氨試液除雜)過程，均不會引起其他皂苷類成分的轉(zhuǎn)化，也不會使溶液中游離黃芪皂苷Ⅳ降解。而正丁醇萃取后再用氨試液除雜(溶液c)，測得的結果顯著升高，與《中國藥典》方法測定的結果一致，表明氨試液除雜過程會提高黃芪皂苷Ⅳ的測定結果。

表2 Y1樣品不同凈化過程下黃芪皂苷Ⅳ的含量Table 2 Contents of astragaloside Ⅳ in Y1 sample under different purification processes

觀察不同提取溫度下索氏提取的回流情況，發(fā)現(xiàn)95 ℃下回流速度是85 ℃的1.5倍，因此相同時間內(nèi)提取溫度越高，提取次數(shù)越多。由表2可知，溶液c在85 ℃和95 ℃下提取5 h的結果無顯著性差異，可推斷這兩個提取溫度不會影響轉(zhuǎn)化后總黃芪皂苷Ⅳ的含量；而溶液a和b的結果有顯著性差異，說明提取溫度會影響樣品中游離黃芪皂苷Ⅳ的含量。因此，選擇索氏提取溫度為95 ℃，對游離黃芪皂苷Ⅳ的提取率更高。

2.3 FT-ICR-MS高分辨質(zhì)譜分析凈化過程中相關成分的差異性

將上述95 ℃下提取的溶液a、b和c分別用UPLC-FT-ICR-MS高分辨質(zhì)譜進行分析，每個溶液重復測定3次，并分別采集正、負離子模式下的總離子流(TIC)圖。從負離子模式下的TIC圖(見圖1)可見有4個峰的強度變化顯著，其中與對照品的保留時間及其精確分子質(zhì)量比對后確認：1號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷(4.1 min,C22H22O10,理論精確分子質(zhì)量為:491.118 40[M+HCOO]-/937.239 70[2M+HCOO]-)；2號峰為黃芪皂苷Ⅳ(12.7 min,C41H68O14,理論精確分子質(zhì)量為:829.458 01[M+HCOO]-)；將精確分子質(zhì)量、保留時間及其碎片離子與相關文獻[8-9]進行比較，3號、4號和5號峰分別指認為黃芪皂苷Ⅱ(15.1 min,C43H70O15,理論精確分子質(zhì)量為:871.468 58[M+HCOO]-)、黃芪皂苷Ⅰ(16.8 min,C45H72O16,理論精確分子質(zhì)量為:913.47814[M+HCOO]-)和丙二酰黃芪皂苷Ⅰ(17.3 min,C48H74O19,理論精確分子質(zhì)量為:953.474 06[M-H]-)。

圖1 提取溫度為95 ℃時不同凈化過程的TIC圖和EIC圖Fig.1 Total ion chromatograms and extracted ion chromatogram of different purification processes at the extract temperature of 95 ℃ solution a:after direct extraction;solution b:after n-butanol extraction;solution c:after impurity removal by ammonia solution

比較相對峰強度后，發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷Ⅱ在溶液b中的相對含量增加，而在溶液c中的相對含量降低，說明有些成分不穩(wěn)定受熱易水解為黃芪皂苷Ⅱ，黃芪皂苷Ⅱ在堿性條件下也會水解。丙二酰黃芪皂苷Ⅰ在正丁醇萃取后(溶液c)的含量顯著降低，說明其在中性條件下不穩(wěn)定。相比其他成分，黃芪皂苷Ⅰ在溶液a中的相對含量最高，在氨試液洗滌后其相對含量顯著降低，同時黃芪皂苷Ⅳ含量顯著升高，由此可認為黃芪皂苷Ⅰ轉(zhuǎn)化為黃芪皂苷Ⅳ的貢獻最大。史靜超等[18]分別測定了16批蒙古黃芪中4種主要皂苷的含量，其前處理過程僅用甲醇索氏提取，結果發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ的含量均較高，其中黃芪皂苷Ⅰ的含量最高，約為黃芪皂苷Ⅳ的10～30倍，其結論與本實驗結果一致。Chu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，中性條件下，丙二酰黃芪皂苷Ⅰ會部分水解為黃芪皂苷Ⅰ；堿性條件下，黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ和丙二酰黃芪皂苷Ⅰ均會部分水解為不含酰基的黃芪皂苷Ⅳ，而丙二酰黃芪皂苷Ⅰ還會部分水解為黃芪皂苷Ⅱ。從唐冕等[19]總結的化學成分可知，黃芪藥材中存在大量含有?；脑碥疹惓煞?，而堿處理過程會導致上述成分脫掉?；?，水解為其他成分，從而不能反映黃芪藥材中原始成分的情況。因此，在研究黃芪藥材中原始成分時，提取工藝不能加堿液，且在保證有效提取率的情況下，應盡量縮短提取時間；為提高黃芪藥材中藥效成分黃芪皂苷Ⅳ的含量，可考慮用適當?shù)膲A液對其進行炮制。

結合本研究的結果，得到其轉(zhuǎn)化途徑如圖2所示。目前已報道[20-21]黃芪藥材中存在黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ和新黃芪皂苷Ⅰ這3個乙酰基在木糖上取代位置不同的異構體，而黃芪皂苷Ⅱ(乙?；谀咎巧系?位)的異構體只報道了1個為異黃芪皂苷Ⅱ(乙?；谀咎巧系?位)。對溶液c提取黃芪皂苷Ⅱ?qū)碾x子，得到的提取離子(EIC)圖(見圖1)中存在分離度較好的3個峰，因此可推斷黃芪藥材中還存在1個乙?；谀咎巧?位的黃芪皂苷Ⅱ異構體，將其命名為新黃芪皂苷Ⅱ。

圖2 中性或堿性條件下4種黃芪皂苷之間的轉(zhuǎn)化途徑Fig.2 The proposed transformation pathways between the four kinds of astragaloside in neutral and alkaline solutions

采用主成分分析(PCA)對上述UPLC-FT-ICR-MS數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，在95%的置信區(qū)間下，根據(jù)PCA得分圖(圖3A)和荷載圖(圖3B)所示，溶液a、b和c的數(shù)據(jù)點被清晰分離。其中溶液a和b均落在負相關區(qū)域，而溶液c處于正相關區(qū)域，說明正丁醇萃取除去的成分相對較少，氨試液洗滌除去的成分相對較多。根據(jù)質(zhì)荷比的偏離程度(圖3B)，得到主要影響得分結果的質(zhì)荷比分別為：m/z491.12(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、829.46(黃芪皂苷Ⅳ)、871.47(黃芪皂苷Ⅱ)、913.48(黃芪皂苷Ⅰ)，該結果進一步確認了上述4種成分為溶液a、b和c的主要差異性成分。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃酮類成分，易溶于堿性溶液，因而正丁醇層的毛蕊異黃酮葡萄糖苷會被氨試液洗滌后除去。

2.4 低分辨質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的黃芪皂苷Ⅳ標準溶液在正、負離子模式下分別進行質(zhì)譜一級全掃描，選出基峰強度較高的母離子進行二級質(zhì)譜分析，最后選擇在正離子模式下[16]進行條件優(yōu)化。黃芪皂苷Ⅳ的[M+Na]+峰m/z807.5響應較高，但選定該母離子做二級質(zhì)譜時，找不到響應較高的定性和定量離子。因此，本實驗選擇[M+H]+峰m/z785.6為MRM掃描的母離子，以響應較高的m/z143.2為定量離子，以m/z473.3為定性離子。此條件下，黃芪皂苷Ⅳ的低分辨質(zhì)譜圖及特征碎片結構如圖4所示。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

本實驗選擇乙腈-水流動相體系，由于流動相中加入甲酸有助于[M+H]+的形成，可提高響應并改善峰形[22]，因此考察了水相分別添加0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨對待測物分離效果和響應強度的影響。結果表明，水相中加入0.1%甲酸后，黃芪皂苷Ⅳ的峰形相對較好，且靈敏度高，故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

考察了不同型號的3種C18色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)(柱A)、Agilent Poroshell 120 SB-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)(柱B)和Agilent HPH C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)(柱C)的分離效果。結果顯示，在一定梯度洗脫程序下，這3種色譜柱均能得到很好的分離效果，而使用色譜柱C所需分析時間最短，因此選擇Agilent HPH C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)作為本方法的分離柱。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

按照“1.4”條件對配制的系列標準工作液進行UPLC-MS/MS測定，以對照品的質(zhì)量濃度(x，mg·L-1)為橫坐標，所得峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示黃芪皂苷Ⅳ在0.387 0～24.75 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，回歸方程為y=3 633x-543，相關系數(shù)(r)為0.999 8。以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD)為1.0 mg/kg；以信噪比S/N=10計算定量下限(LOQ)為3.0 mg/kg。

2.7 回收率與相對標準偏差

取Y1樣品，分別進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，索氏提取前，分別準確加入198 mg/L的黃芪皂苷Ⅳ標準儲備溶液0.2、1、5 mL，在95 ℃下用甲醇索氏提取5 h，提取溶液均定容至100 mL；另取6份Y1樣品，采用上述提取條件進行精密度實驗。結果顯示，低、中、高3個加標水平下的回收率為94.5%～105%，6份平行樣品的相對標準偏差(RSD)為1.4%，表明該方法具有較好的準確度和精密度，適用于黃芪藥材中黃芪皂苷Ⅳ的含量測定。

3 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷Ⅳ含量測定的前處理過程中氨試液除雜會導致大量黃芪皂苷Ⅳ同系物水解為黃芪皂苷Ⅳ，從而顯著提高黃芪皂苷Ⅳ的含量。其中，甲醇直接提取測得的黃芪皂苷Ⅰ相對含量最高，且在堿處理后可徹底水解為具有多種藥理活性的黃芪皂苷Ⅳ。按2015年版《中國藥典》測定的不是游離黃芪皂苷Ⅳ，還包含其他皂苷類成分水解后的含量。此外，還發(fā)現(xiàn)黃芪藥材中存在目前尚未報道的黃芪皂苷Ⅱ異構體，將其命名為新黃芪皂苷Ⅱ。本研究建立的黃芪藥材中游離黃芪皂苷Ⅳ含量的測定方法，具有操作簡單、靈敏度高、穩(wěn)定可靠等特點，可準確反映黃芪藥材的質(zhì)量情況。