韓苗苗，王 萍，席守民

(河南科技大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471000)

DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)、也是研究最深入的表觀遺傳修飾之一。它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，將甲基基團(tuán)結(jié)合到胞嘧啶的C-5位，在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸中形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)的過程。在真核生物DNA中，約3%～8%的胞嘧啶殘基被甲基化[1]，而異常的甲基化狀態(tài)(低甲基化或高甲基化)又與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如糖尿病[2]、冠狀動(dòng)脈疾病[3-4]、帕金森氏癥[5]、腫瘤[6-7]等。因此，DNA甲基化的檢測對(duì)于這些疾病的預(yù)測和預(yù)后具有重要意義。

目前已經(jīng)建立了許多用于檢測DNA甲基化的方法，常用的方法包括亞硫酸氫鹽測序法[8]、甲基化特異性PCR(MSP)[9-10]、甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR(MSRE-PCR)[11-12]、甲基化敏感的高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)[13-14]和變性高效液相色譜(DHPLC)[15-16]。盡管亞硫酸氫鹽測序法被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但它通常需要大量的基因組DNA作為起始物質(zhì)，并且在修飾過程中存在DNA降解的固有問題[17]。此外，上述所有方法都依賴于PCR設(shè)備的使用，使得這些方法成本昂貴、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)且復(fù)雜。為了克服常規(guī)DNA甲基化檢測方法的缺點(diǎn)，已出現(xiàn)了一些用于DNA甲基化檢測的新方法，如比色法[18-19]、基于熒光的生物傳感器[20-21]、電化學(xué)發(fā)光法[22]、表面等離子體共振(SPR)生物傳感器[23-24]、電化學(xué)法[25-28]等。其中，基于電化學(xué)的DNA甲基化分析方法因其操作簡便、靈敏度高、成本低且易于自動(dòng)化和便攜化等優(yōu)點(diǎn)而受到了廣泛關(guān)注[29]。

電化學(xué)生物傳感器捕獲探針的結(jié)構(gòu)對(duì)檢測靈敏度和特異性至關(guān)重要。在典型的電化學(xué)傳感器構(gòu)建過程中，需將巰基修飾的單鏈DNA(ssDNA)探針[30]、發(fā)夾型DNA探針[31]、肽核酸探針[32]和鎖核苷酸探針[33]固定在電極表面作為捕獲探針與靶標(biāo)雜交。為了和靶標(biāo)分子更好地結(jié)合，這些捕獲探針必須保持垂直排列，因而需要使用封阻劑保持探針的方向性，且這些探針的密度也很難控制，從而影響了捕獲探針與靶標(biāo)分子之間的雜交效率，以及檢測的準(zhǔn)確性[34-35]。為了解決此問題，開發(fā)了DNA四面體納米結(jié)構(gòu)探針(TSP)作為識(shí)別探針。與常規(guī)的捕獲探針相比，TSP具有優(yōu)異的性能，如機(jī)械剛度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、可控的探針間距和方向性[36-37]。

為了提高檢測靈敏度，信號(hào)放大也被廣泛用于電化學(xué)生物傳感器。納米金顆粒(AuNPs)因具有高的比表面積和獨(dú)特的理化特性而成為最常用的納米材料之一[38-39]，其可與DNA、抗體和酶偶聯(lián)以增強(qiáng)檢測信號(hào)。研究表明，用辣根過氧物酶標(biāo)記的IgG抗體(IgG-HRP)修飾的AuNPs可顯著提高免疫分析和電化學(xué)分析的檢測靈敏度[40-41]。

本研究基于電沉積納米金顆粒和AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物的信號(hào)增強(qiáng)作用，結(jié)合TSP的特異識(shí)別功能，建立了一種簡單靈敏、易于操作的電化學(xué)生物傳感器用于DNA甲基化的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Autolab電化學(xué)工作站(荷蘭Metrohm Autolab公司)，實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)的三電極體系：修飾后的金電極為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。

四氯金酸三水合物(HAuCl4·3H2O)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)和氫醌(HQ)均購自上海阿拉丁公司;5-甲基胞嘧啶(5-mc)單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG-HRP購自美國Abcam公司；牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶公司；直徑15 nm的AuNPs購自上海水源生物科技有限公司；測試底液為磷酸鹽緩沖液(PBS)。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

實(shí)驗(yàn)所用的核酸序列由上海生工生物工程有限公司合成(見表1)。用TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0)將核酸序列稀釋，并保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)所用核酸序列Table 1 The base sequences of nucleic acid used in this experiment

1.2 金電極的處理

依次用粒徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末打磨金電極(AuE，直徑2.0 mm)，再將AuE放在無水乙醇和水中各超聲清洗3 min。待AuE在室溫下自然晾干后，將電極插入0.5 mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法(CV)清洗活化，掃描范圍為-0.3～1.55 V，直至出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)、重復(fù)的CV曲線，隨后用水將電極表面徹底淋洗干凈并用氮?dú)獯蹈?。將AuE浸入含10 mmol/L HAuCl4的0.5 mol/L H2SO4溶液中，于-0.2 V恒電位下電化學(xué)沉積納米金200 s，再次充分淋洗電極，并用氮?dú)獯蹈?，即得納米金修飾的金電極，標(biāo)記為AuNPs/AuE。

1.3 TSP的制備

將S1、S2、S3和S4四條ssDNA溶解在TE緩沖液中，使每條鏈的終濃度為50 μmol/L。分別吸取1 μL上述ssDNA加入EP管中，再加入 41 μL TM緩沖液(20 mmol/L Tris，50 mmol/L MgCl2，pH 8.0)和5 μL 30 mmol/L的TCEP溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。振蕩混勻后于PCR儀中將混合物加熱至95 ℃,并保持2 min，然后在4 ℃下冷卻30 s，通過熱變性法自組裝形成TSP，保存于4 ℃?zhèn)溆?，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行表征。

1.4 AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物的制備

根據(jù)已有文獻(xiàn)制備AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物[42]。首先，用0.1 mol/L K2CO3將1 mL AuNPs溶液調(diào)至pH 8.3。在緩慢攪拌下，將不同體積的IgG-HRP(2.0 mg/mL)加至AuNPs溶液中，室溫靜置30 min后，將100 μL 10% BSA加至上述溶液中，室溫孵育15 min。接著，將混合物在4 ℃以6 000 r/min離心10 min，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在4 ℃再次以12 000 r/min離心20 min以除去未結(jié)合的IgG-HRP。棄上清，將沉淀重懸于100 μL重懸液(10 mmol/L PBS含5%蔗糖、0.5%BSA、0.5%Tween-20和0.2%PEG 20000，pH 7.4)中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

將4 μL新鮮制備的TSP加至AuNPs/AuE電極表面，于4 ℃過夜，使末端巰基化的探針通過Au—S鍵固定在電極表面。待探針固定后，用10 mmol/L PBS充分淋洗電極以去除多余吸附的探針，并用氮?dú)獯蹈?，此電極標(biāo)記為TSP/AuNPs/AuE。接著，在電極表面滴加5 μL用雜交緩沖液(10 mmol/L PB中含20 mmol/L MgCl2，1 mol/L NaCl，pH 7.4)稀釋的不同濃度靶標(biāo)甲基化DNA序列，并在37 ℃孵育20 min。電極取出后，用10 mmol/L PBS徹底沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，此電極標(biāo)記為DNA/TSP/AuNPs/AuE。然后，將10 μL 0.05%的BSA滴至電極表面，室溫孵育30 min，以封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用10 mmol/L PBS徹底沖洗電極后，氮?dú)獯蹈?，? μL 5-mc抗體(2.0 μg/mL)滴至電極表面，在37 ℃下孵育1 h，用10 mmol/L PBS沖洗電極，氮?dú)獯蹈?，此電極標(biāo)記為antibody/DNA/TSP/AuNPs/AuE。最后，將5 μL AuNPs-IgG-HRP滴至電極表面，并在室溫下孵育30 min，將電極用10 mmol/L PBS沖洗后，氮?dú)獯蹈桑穗姌O標(biāo)記為HRP/antibody/DNA/TSP/AuNPs/AuE，該修飾完成的電極為工作電極，可用于電化學(xué)信號(hào)測定。

1.6 電化學(xué)信號(hào)的檢測

采用CV和電化學(xué)阻抗譜(EIS)對(duì)電極的修飾性能進(jìn)行表征，CV和EIS的測試溶液均為含5 mmol/L鐵氰化鉀([Fe(CN)6]3-/4-，1∶1，摩爾比)的0.1 mol/L KCl溶液。CV測定的電壓范圍為-0.2～0.6 V，掃描頻率為0.05 V/s。EIS測量參數(shù)如下：頻率范圍為10-1～105Hz；初始電位為0.24 V；振幅為0.005 V；靜置時(shí)間2 s。差分脈沖伏安法(DPV)在10 mL含4.0 mmol/L H2O2和1.5 mmol/L HQ的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中執(zhí)行。檢測參數(shù)設(shè)置為：電壓范圍為0.2～-0.3 V，脈沖幅度0.05 V；脈沖寬度0.05 s；樣品寬度0.016 7 s；脈沖周期0.2 s；靜置時(shí)間2 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)傳感器的檢測原理

本研究采用TSP作為捕獲探針，TSP的3個(gè)頂點(diǎn)通過Au—S鍵組裝在AuNPs/AuE電極表面，第4個(gè)頂點(diǎn)延伸出一段ssDNA序列可與靶標(biāo)甲基化DNA雜交。接著，加入5-mc單克隆抗體以識(shí)別單鏈靶標(biāo)DNA上的5-mc位點(diǎn)。隨后，加入AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物，由于羊抗鼠IgG可以與5-mc抗體特異性結(jié)合，因此通過免疫反應(yīng)可將AuNPs-IgG-HRP信號(hào)放大單元捕獲到電極上。由于AuNPs具有很大的比表面積，因此可以負(fù)載大量IgG-HRP分子。HRP可以在過氧化氫(H2O2)存在下，催化HQ氧化生成苯醌(BQ)，產(chǎn)生DPV電流。通過檢測電流，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)甲基化DNA的檢測(見圖1)。

圖1 基于DNA四面體納米結(jié)構(gòu)探針的電化學(xué)傳感器檢測DNA甲基化的原理圖Fig.1 Schematic of the electrochemical sensor based on DNA tetrahedral nanostructure probes for detecting DNA methylation

圖2 瓊脂糖凝膠電泳表征TSP合成Fig.2 Agarose gel electrophoresis to characterize TSP synthesis M:25 bp DNA marker;1:S1;2:S1+S2;3:S1+S2+S3; 4:S1+S2+S3+S4

2.2 TSP合成效果的瓊脂糖凝膠電泳表征

圖2是單鏈(S1)、兩條鏈(S1+S2)、三條鏈(S1+S2+S3)和四條鏈(S1+S2+S3+S4)DNA通過一步熱變性法合成后，在3%瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果。從圖中可以看出，隨著各鏈復(fù)雜程度和堿基數(shù)的增加，條帶的遷移速率減慢。泳道4是TSP產(chǎn)物，由于它的堿基數(shù)最多且具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其遷移速率最慢，這與以往報(bào)道一致[40]，證明TSP已成功組裝。

2.3 傳感器層層組裝的電化學(xué)表征

在含5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)的0.1 mol/L KCl溶液中，考察了不同傳感器的CV圖(見圖3A)，其中曲線a為裸金電極的CV曲線，b、c、d、e、f分別為AuNPs/AuE、TSP/AuNPs/AuE、DNA/TSP/AuNPs/AuE、antibody/DNA/TSP/AuNPs/AuE和HRP/antibody/DNA/TSP/AuNPs/AuE的CV曲線。沉積金后電極的氧化還原電流峰值最大(曲線b)，這是由于AuNPs具有優(yōu)異的電導(dǎo)率，可增加電極的有效表面積并促進(jìn)電子傳輸速率，而更大的表面積還將有助于固定更多的TSP，為后續(xù)的雜交和信號(hào)放大奠定基礎(chǔ)；隨后依次進(jìn)行TSP的固定、靶標(biāo)DNA的雜交、一抗的結(jié)合和AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物的組裝，得到的氧化還原電流逐漸減小，這是由于在電極表面的層層修飾過程中，阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，從而使電流強(qiáng)度逐漸減小。

進(jìn)一步在含5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(1∶1)的0.1 mol/L KCl溶液中，考察了上述不同傳感器的EIS圖，結(jié)果見圖3B。從圖中可以看出，與裸金電極(曲線a)相比，沉積金后電極(曲線 b)的阻抗值減小，EIS 曲線接近一條直線，這是由于AuNPs能增加電子傳遞效率；TSP修飾后的電極(曲線c)所產(chǎn)生的阻抗值增加，表明TSP成功固定到電極表面；隨后依次進(jìn)行靶標(biāo) DNA 的捕獲、一抗的結(jié)合和AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物的組裝，得到的阻抗值依次增大，與圖3A中CV曲線的變化趨勢一致，進(jìn)一步表明傳感器已構(gòu)建成功。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 雜交時(shí)間的優(yōu)化雜交時(shí)間是影響傳感器性能的重要因素，如圖4A所示，研究了100 pmol/L靶標(biāo)甲基化DNA在5～40 min內(nèi)與TSP的雜交情況。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的增加，響應(yīng)電流值不斷增大，并在20 min時(shí)達(dá)到最高值，之后電流響應(yīng)值隨著時(shí)間變化趨于平緩。因此，實(shí)驗(yàn)選擇20 min作為雜交時(shí)間。

2.4.2 5-mc抗體濃度的優(yōu)化5-mc抗體的濃度直接影響與甲基化DNA中5-mc位點(diǎn)的結(jié)合。為了獲得最佳的檢測靈敏度，對(duì)5-mc抗體的質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖4B所示。由圖可知，當(dāng)5-mc抗體質(zhì)量濃度從0.25 μg/mL增至2.0 μg/mL時(shí)，響應(yīng)電流值隨著濃度的增加而增加，并在質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值，繼續(xù)增大5-mc抗體濃度的值，則響應(yīng)電流降低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇2.0 μg/mL作為5-mc抗體的最佳濃度。

2.4.3 IgG-HRP體積的優(yōu)化作為信號(hào)放大單元，在電極上捕獲的AuNPs-IgG-HRP數(shù)量越多，傳感器的靈敏度就越高。在復(fù)合物標(biāo)記過程中，加入一系列不同體積(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL)的2 mg/mL IgG-HRP，對(duì)其在AuNPs上的結(jié)合進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖4C所示。結(jié)果表明，在復(fù)合物制備過程中，當(dāng)IgG-HRP的加入體積為7.5 μL時(shí)，電流響應(yīng)值趨于平衡并達(dá)到最大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇7.5 μL作為IgG-HRP的最佳加入體積。

2.4.4 HQ和H2O2濃度的優(yōu)化考察了不同HQ(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)和H2O2濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L)對(duì)檢測靈敏度的影響。結(jié)果顯示，體系的電流值隨著HQ濃度的增大而增大，并在1.5 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值(見圖4D)。隨著H2O2濃度從1.0 mmol/L增加到5.0 mmol/L，體系的響應(yīng)電流值逐漸增加，并在4.0 mmol/L時(shí)達(dá)到峰值，之后電流響應(yīng)值變化趨于平緩。因此，實(shí)驗(yàn)選擇1.5 mmol/L HQ和4.0 mmol/L H2O2作為最佳濃度。

圖5 甲基化DNA在不同濃度下的DPV曲線Fig.5 DPV curves obtained in different concentrations of methylated DNA concentration (a-j):1.0×10-17,1.0×10-16,1.0×10-15,1.0× 10-14,1.0×10-13,1.0×10-12,1.0×10-11,1.0×10-10, 1.0×10-9,1.0×10-8 mol/L；insert:relationship between DPV peak current and concentrations of methylated DNA

2.5 電化學(xué)傳感器的分析性能

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，研究甲基化DNA濃度與電流響應(yīng)值的關(guān)系。隨著甲基化DNA濃度在1.0×10-17～1.0×10-10mol/L范圍內(nèi)不斷增大，體系的DPV電流響應(yīng)值也不斷增加，并在高濃度時(shí)趨于平穩(wěn)(圖5)。在1.0×10-15～1.0×10-10mol/L范圍內(nèi)，甲基化DNA濃度的對(duì)數(shù)(lgc)與DPV相應(yīng)電流(I)之間呈線性關(guān)系，其線性方程為I=0.134 5lgc+2.374 3，r2= 0.994(見圖5插圖)，檢出限(S/N=3)為4.4×10-16mol/L。

圖6 傳感器的特異性分析Fig.6 The specificity of the biosensor

2.6 傳感器的特異性與穩(wěn)定性

特異性是電化學(xué)生物傳感器的一項(xiàng)重要參數(shù)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用所構(gòu)建的傳感器對(duì)100 pmol/L的甲基化靶序列、非甲基化靶序列和隨機(jī)DNA序列的檢測信號(hào)進(jìn)行評(píng)估(見圖6)。由圖可看出，所構(gòu)建的傳感器對(duì)甲基化靶序列的電流響應(yīng)值遠(yuǎn)高于非甲基化靶序列和隨機(jī)DNA序列，表明構(gòu)建的傳感器具有良好的特異性。

以1.0×10-10mol/L的甲基化DNA作為研究對(duì)象，將組裝好的傳感器在10 mL含4.0 mmol/L H2O2和1.5 mmol/L HQ的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中進(jìn)行DPV檢測，重復(fù)檢測5次，最終得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%，說明該電化學(xué)生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了以TSP作為捕獲探針和AuNPs-IgG-HRP復(fù)合物作為信號(hào)放大單元的電化學(xué)傳感器用于檢測甲基化DNA。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器對(duì)甲基化DNA的線性范圍為1.0×10-15～1.0×10-10mol/L，檢出限為4.4×10-16mol/L。所制備的電化學(xué)生物傳感器對(duì)甲基化DNA具有寬的線性范圍和良好的特異性，為甲基化DNA的檢測提供了一種新思路。