劉玉盒，陳慧

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730030；2甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

Graves病(GD)是常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺疾病，世界范圍內(nèi)患病率女性約為3%、男性約為0.5%[1]。促甲狀腺激素受體(TSHR)是GD特異性抗原，GD是靶向TSHR抗原導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)的自身免疫性甲狀腺疾病，是環(huán)境因素相關(guān)的遺傳易感人群對(duì)TSHR抗原的耐受性喪失[2]。TSHR位于甲狀腺上皮細(xì)胞表面，為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，生理?xiàng)l件下TSH與其受體TSHR結(jié)合，經(jīng)G蛋白激活產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)。而GD病理情況下，TSHR激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生TSHR自身抗體(TRAb)，TRAb分為刺激性抗體(TSAb)和抑制性抗體(TBAb)，TSAb的生物效應(yīng)類似(TSH)，可與TSH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在TSHR上，通過(guò)產(chǎn)生cAMP，刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞分泌合成甲狀腺素，繼而可引起GD，激活TSHR的促甲狀腺抗體(TSAb)是GD甲狀腺功能亢進(jìn)癥的直接原因。TBAb由于可以阻斷TSHR的信號(hào)傳遞，部分甲狀腺功能減退癥和甲狀腺萎縮是由TSH阻斷抗體(TBAb)引起的[3]。母體的TSHR自身抗體會(huì)通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)移在新生兒中引起短暫的GD[4]，注射單克隆刺激性TSHR抗體足以誘發(fā)小鼠甲狀腺功能亢進(jìn)[5]。因此探討TSHR及其亞基的結(jié)構(gòu)、A亞基的脫落機(jī)制以及TSHR致機(jī)體產(chǎn)生自身抗體產(chǎn)生的原理及其兩者之間的相互作用是研究GD發(fā)病、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵，同時(shí)為改進(jìn)診斷和治療GD病尋找新潛能?，F(xiàn)就TSHR A亞基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、重組表達(dá)及應(yīng)用研究進(jìn)展情況作一綜述。

1 TSHR A亞基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

TSHR由764個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為85 kD，由膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)三部分組成，是一種七次跨膜糖蛋白受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族(GPCRs)的一員。膜外區(qū)有418個(gè)氨基酸，呈親水性，包含一個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)一個(gè)鉸鏈區(qū)與跨膜結(jié)構(gòu)域相連，在翻譯后加工過(guò)程中，TSHR的膜外區(qū)可在兩個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)裂解而形成兩個(gè)亞基，即A亞基和B亞基。TSHR1-22殘基為信號(hào)肽，殘基22-289包括整個(gè)TSHR富含亮氨酸的區(qū)域(LDR)和鉸鏈區(qū)域的近端部分[稱為信號(hào)特異性區(qū)域(SSD)]，LRD和SSD一起構(gòu)成了A亞基，A亞基缺少TSHR胞外結(jié)構(gòu)域的C端(氨基酸290-418)以及3個(gè)胞外環(huán)。位于第317～366位的氨基酸，可能是TSHR羧基端與氨基端相連接的部位，可稱之為連接肽或者C肽，A亞基通過(guò)C肽與B亞基通過(guò)半胱氨酸殘基構(gòu)成的二硫鍵結(jié)合在一起。與其他的促性腺激素受體不同，TSHR可被分割成亞基，斷裂二硫鍵會(huì)導(dǎo)致TSHR A亞基的脫落[6]，這些促性腺激素受體不會(huì)在人體中誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。并且強(qiáng)有力的證據(jù)表明脫落的TSHR A亞基，并非TSHR整體受體促進(jìn)機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，從而誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)[7]。研究者將125I-TSH與甲狀腺、FRTL-5大鼠甲狀腺細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)TSHR是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為80 kD的異二聚體，包含兩個(gè)大小不同的亞基，一分子量大約為45 kD，存在于甲狀腺細(xì)胞膜外，親水性，是125I-TSH結(jié)合的位點(diǎn)，稱為A亞基，另一個(gè)分子量大小約25 kD，通過(guò)二硫鍵連接在A亞基上，稱為B亞基[8]。TSHR A亞基蛋白分子量較小，而且在甲狀腺中的含量非常低。TSHR是由單個(gè)mRNA編碼的，因此TSHR亞基是由單個(gè)多肽鏈分子內(nèi)裂解形成的，在TSHR蛋白合成后期，即在高爾基復(fù)合體上或在甲狀腺細(xì)胞表面，TSHR被切割成A和B亞基[9]。用TSHR特異性單克隆抗體觀察到人胸腺細(xì)胞TSHR的A亞基比B亞基少3倍[10]，重組表達(dá)人TSHR的小鼠骨髓瘤細(xì)胞核中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)均觀察到A亞基數(shù)量少于B亞基[11]，因此認(rèn)為甲狀腺細(xì)胞表面，鉸鏈區(qū)的二硫鍵斷裂導(dǎo)致A亞基脫落，成為GD的自身抗原，產(chǎn)生促甲狀腺素受體抗體(TRAb)[12]。在非生理?xiàng)l件，如甲狀腺組織勻漿反復(fù)凍融或甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)液胎牛血清濃度降低的情況下，TAHR的A亞基脫落明顯，可能A亞基脫落與細(xì)胞活力下降或蛋白自噬相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二硫異構(gòu)酶(PDI)和硫氧還蛋白是已知細(xì)胞表面減少二硫鍵形成的酶，使用PDI特異性單克隆抗體抑制PDI酶活性，TSHR的A亞基脫落明顯減少。二硫異構(gòu)酶可能參與A亞基的脫落[13]。

2 TSHR A亞基的重組表達(dá)

甲狀腺組織中TSHR分子量極少，大約每個(gè)甲狀腺細(xì)胞少于5 000個(gè)，并且TSHR蛋白的高度構(gòu)象性或外顯子區(qū)的糖基聚糖含量極高使其純化受到了極大阻礙，然而為進(jìn)一步探討TSHR的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、GD的發(fā)病機(jī)制及可能的免疫治療，都需要高水平的純化蛋白[14]。決定是表達(dá)整體受體還是外顯子在很大程度上取決于重組TSHR的預(yù)期用途，TSHR全長(zhǎng)具有跨膜片段是研究TSHR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件，如果研究TSH或TRAb與TSHR蛋白的結(jié)合機(jī)制、或產(chǎn)生TSHR特異性單克隆抗體等，外顯子或外顯子結(jié)構(gòu)的一部分更有利。近20年來(lái)，人們一直努力在各種系統(tǒng)中表達(dá)TSHR及其片段蛋白，原核細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞克隆表達(dá)的重組蛋白及合成肽均無(wú)法與TSH和TRAb結(jié)合。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是生成構(gòu)象完整的TSHR最有效的方法，重組蛋白具有TSHR生理功能，穩(wěn)定表達(dá)TSHR的細(xì)胞在TSH和TSHR自身抗體刺激后傳遞信號(hào)，然而雖然這種表達(dá)水平遠(yuǎn)高于甲狀腺組織，但表達(dá)量仍然太低，每個(gè)細(xì)胞有2 000～5 000個(gè)受體，仍不能純化TSHR[15]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，TSHR胞外結(jié)構(gòu)域以含有未成熟的高甘露糖碳水化合物的形式保留在細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì)TSHR外顯子結(jié)構(gòu)域羧基端逐步截短可以克服這一困難，如截短為外域體TSHR-261、TSHR-289、TSHR-309，不同外域體分泌于培養(yǎng)基的量與其大小成反比，且其能有效的與GD患者血清結(jié)合[16]。3BD10為轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)的TSHR A亞基(TSHR-289)獲得的單克隆抗體(MAb)，CHO細(xì)胞表達(dá)的TSHR A亞基只有部分能被3BD10識(shí)別，此部分不能被GD患者血清TRAb識(shí)別，而能被GD患者血清TRAb識(shí)別的部分，無(wú)法被3BD10識(shí)別，遂將能被GD患者血清TRAb識(shí)別的TSHR A亞基結(jié)構(gòu)形式稱為活性形式，能被3BD10識(shí)別的稱為非活性形式。活性TSHR-289完全中和了所有血清中TSAb的活性，相同數(shù)量的非活動(dòng)TSHR-289對(duì)TSAb活性無(wú)中和作用[17]。重組TSHR A蛋白的這種活性，可以用3BD10柱將兩者依次分離純化，活性和非活性TSHR A亞基考馬斯染色具有相同的摩爾大小，相同的多肽骨架，糖基化程度都較高，37 ℃加熱1 h重組TSHR A亞基從活性形式轉(zhuǎn)化為非活性形式，然而在純化的活性形式TSHR-A亞基中加入一種化學(xué)伴侶三甲胺N-氧化物，可防止其轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚孕问?，即使加熱?7 ℃持續(xù)30 h也，僅在折疊上存在差異。2015年，Chen等[18]通過(guò)晶體x衍射解析出3BD 10和TSAb都能與真核細(xì)胞表達(dá)的TSHR A亞亞基單體結(jié)合，活性和非活性A-亞基均是多聚體，分別是三聚體和二聚體。

3 TSHR A亞基的應(yīng)用

3.1 用于GD動(dòng)物模型的構(gòu)建 如果不進(jìn)行主動(dòng)免疫接種，僅僅有實(shí)驗(yàn)室培育的大鼠，非肥胖糖尿病(NOD)和NOD.H2h4小鼠以及某些犬類、部分猴可自發(fā)發(fā)生自身免疫性甲狀腺炎，但與TSHR抗體和GD的甲狀腺功能亢進(jìn)癥均不會(huì)在動(dòng)物中自發(fā)發(fā)生，GD僅影響人類。與自身免疫性甲狀腺炎不同，通過(guò)注射甲狀腺提取物等常規(guī)方法不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生TSAb，并導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)癥的。成功誘發(fā)GD或其標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)是存在生物活性抗體(TSAb)和(或)甲狀腺功能亢進(jìn)癥。用TSHR蛋白進(jìn)行常規(guī)免疫接種既不會(huì)誘導(dǎo)TSAb也不會(huì)誘導(dǎo)甲狀腺功能亢[19]。用重組TSHR蛋白與多種佐劑一起注入許多不同的小鼠品系，可在ELISA中誘導(dǎo)結(jié)合TSHR蛋白的抗體，但是，這些抗體缺乏刺激從表達(dá)TSHR的細(xì)胞釋放cAMP的能力(即沒(méi)有生物活性，小鼠仍處于甲狀腺功能正常狀態(tài)，可能小鼠TSHR的耐受性不會(huì)被人TSHR免疫所破壞。通過(guò)給小鼠注射表達(dá)TSHR的完整細(xì)胞，可以誘導(dǎo)出刺激TSAb[20]。用人TSHR A亞基免疫的小鼠的T細(xì)胞不會(huì)與小鼠TSHR肽段交叉反應(yīng)，一種很少使用的方法是用表達(dá)TSHR的B細(xì)胞和TSHR蛋白質(zhì)和佐劑免疫小鼠[21]。通過(guò)使用質(zhì)?；蛳俨《据d體在小鼠體內(nèi)表達(dá)TSHR體或其A亞基可有效誘導(dǎo)TSAb和(或)甲狀腺功能亢進(jìn)，經(jīng)過(guò)20年探索，目前使用最廣泛的是Ad-TSHR-289誘導(dǎo)的GD模型，該模型用A亞單位的重組腺病毒免疫雌性BALB/c小鼠所形成，其特點(diǎn)主要有甲狀腺腫大、血清促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)以及總甲狀腺素(TT4)水平增高、甲狀腺組織病理符合甲亢表現(xiàn)等[22]。與不會(huì)分裂為兩個(gè)亞基的TSHR免疫相比，用A亞基免疫小鼠可更有效地誘導(dǎo)甲亢，Chen等分別采用人腺病毒-TSHR-A亞基、腺病毒-TSHR全長(zhǎng)免疫BALB/c雌鼠，結(jié)果顯示Ad-TSHR-289組80%小鼠T4水平增高，而Ad-TSHR全長(zhǎng)組僅為10%，A亞單位組的TSAb活性明顯高于全長(zhǎng)組，說(shuō)明TSHR-A亞單位具有更強(qiáng)的免疫原性，相比TSHR全長(zhǎng)能更有效的誘導(dǎo)小鼠GD[23]。采用腺病毒-TSHR A亞基電穿孔(EP)技術(shù)進(jìn)行基因免疫，有效地誘導(dǎo)出小鼠甲亢，并且TSAb抗體超過(guò)8月仍持續(xù)存在[24]。甚至運(yùn)用腺病毒TSHR A亞基肌肉電穿孔成功構(gòu)建GD眼病模型，出現(xiàn)了眼眶肌肉肥大、視神經(jīng)周圍大量浸潤(rùn)、廣泛脂肪形成，球后脂肪組織擴(kuò)張、新生及擴(kuò)張的眼眶血管等眼眶病變[25]。此外研究認(rèn)為，CD40是與自身免疫性甲狀腺疾病相關(guān)的基因之一，甲狀腺中CD40的過(guò)表達(dá)會(huì)增加人A亞單位腺病毒免疫誘導(dǎo)鼠GD的嚴(yán)重性[26]。

3.2 用于GD自身抗原免疫特異性的治療 近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，GD的治療都未有大的改進(jìn)和突破，新興起的非特異性免疫治療方法包括TSHR功能的小分子抑制劑，阻斷TSAb功能的抗體，以及針對(duì)B淋巴細(xì)胞適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抑制劑(如利妥昔單)，亦都只是可以治療但不能治愈GD，并且非特異性免疫抑制劑有潛在的嚴(yán)重副作用[27]。在表達(dá)TSHR A亞基的腺病毒誘導(dǎo)GD模型中，用TSHR合成肽預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)腺病毒-TSHR A亞基的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答都減弱[28]。在未激活先天免疫系統(tǒng)的情況下預(yù)先施用TSHR A亞基蛋白會(huì)誘導(dǎo)耐受性，從而通過(guò)隨后的A亞基腺病毒免疫減弱甲亢的誘導(dǎo)。遂運(yùn)用真核細(xì)胞CHO克隆表達(dá)的TSHR A亞基預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其可抑制甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀，但仍無(wú)法徹底治愈甲亢，蛋白預(yù)處理并沒(méi)有誘導(dǎo)耐受，而是將抗體反應(yīng)從TSAb轉(zhuǎn)移到TBAb上;相反，甲亢誘導(dǎo)后再注射TSHR A亞基蛋白無(wú)效[29]。注射TSHR A亞基可以使TSAb向非功能性刺激抗體的轉(zhuǎn)變是否可以治療GD？然而注射TSHR A亞基蛋白抗原可能激活TSHR特異性T細(xì)胞，因此考慮將A亞基蛋白疫苗接種方法用于人類之前，必須確保注射它不會(huì)激活TSHR特異性T細(xì)胞并促進(jìn)或加劇GD眼病。研究者將新生兒耐受性的作用原理應(yīng)用于小鼠GD的TSHR-腺病毒模型，出生后24 h內(nèi)向小鼠注射大劑量的TSHR-Ad可建立耐受性，并防止隨后誘發(fā)TSAb和GD甲狀腺功能亢進(jìn)，但低劑量TSHR-Ad無(wú)效[30]。NOD.H-2h4小鼠(NOD小鼠與B10.A(4R)雜交小鼠)可自發(fā)地發(fā)生自身免疫性甲狀腺炎，并且有較高的發(fā)病率，能自發(fā)地產(chǎn)生TPO、TG抗體，但不會(huì)產(chǎn)生TSHR抗體[31]。將人TSHR A亞基導(dǎo)入NOD.H2h4小鼠甲狀腺，可自發(fā)產(chǎn)生TSHR抗體，建立自發(fā)GD模型，然而其TSAb對(duì)NOD.H2h4小鼠TSHR有較小的抑制作用，血清中雖存在有活性TSAb，但無(wú)甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀[32]。將人TSHR A亞基轉(zhuǎn)移到NOD.H-2h4小鼠導(dǎo)致對(duì)該蛋白的耐受性喪失，注射TSHR A亞單位蛋白通過(guò)將致病的TSHR抗體轉(zhuǎn)化為非功能性TRAb來(lái)減輕甲亢，然而給TSHR/NOD.H-2h4小鼠注射非活性形式的重組TSHR-A亞基(不添加佐劑)，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TSAb水平提高了[33]。使用納米粒子(NPs)來(lái)傳遞耐受性分子，使機(jī)體產(chǎn)生耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的呈遞，運(yùn)用納米粒子抗原傳遞方法，NOD小鼠未發(fā)生Ⅰ型糖尿病。使用重組TSHR A亞基蛋白聯(lián)合同樣的納米粒子(NPs)傳遞的耐受性分子免疫TSHR/NOD.H-2h4小鼠，可能為一種有效的GD的治療方法。誘導(dǎo)自我耐受以預(yù)防自身免疫性甲狀腺疾病的目標(biāo)將需要對(duì)有風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，并采用抗原特異性的治療方法。

總之，TSHR A亞基在促甲狀腺素抗體(TRAb)的產(chǎn)生、TRAb與TSHR相互作用和刺激、阻斷TSHR的分子機(jī)制，檢測(cè)患者血清中TRAb以及GD的進(jìn)一步診治、甚至預(yù)防等方面均有重大的意義。TSHR A亞基蛋白聯(lián)合納米分子可能成為一種有效的治療GD新方法，對(duì)于人體自身免疫性疾病也可能成為重大突破，但大量高純度有活性TSHR A亞基蛋白的獲得仍是關(guān)鍵。