王向遠，郭青龍，惠慧

（江蘇省南京市鼓樓區(qū)童家巷24號中國藥科大學(xué)玄武門校區(qū)，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點實驗室，江蘇 南京）

0 引言

細胞周期的進展受嚴密調(diào)控因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制，其中關(guān)鍵是細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk / Cdc）[1]。細胞周期控制機制的崩潰是癌癥的重要特征之一，而靶向細胞周期調(diào)控是癌癥治療中反復(fù)出現(xiàn)的主題[2]。與化學(xué)療法相比，靶向療法具有最大化療效和降低毒性的優(yōu)勢[3,4]。臨床前研究已經(jīng)確定了幾個潛在的靶標，而CDK9是最近引起人們越來越多興趣的藥物靶標之一。抑制CDK9能夠選擇性地降低許多癌癥中上調(diào)的蛋白質(zhì)，從而引起細胞增殖抑制和凋亡[5]。CDK9抑制劑單獨使用以及與常規(guī)化療（例如抗代謝物或微管抑制劑）聯(lián)用的方案都進入了臨床研究階段[6]。

1 CDK9的發(fā)展簡述

細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）家族由以下成員組成，這些成員是細胞分裂周期的關(guān)鍵調(diào)控因子（細胞周期CDK），參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白（轉(zhuǎn)錄CDK）以及具有其他功能的CDK，例如CDK5參與正常的神經(jīng)元遷移和分化，軸突伸長和突觸[7]。細胞分裂周期的正確時機和順序需要細胞周期CDK 1、2、3、4和6，而轉(zhuǎn)錄CDK7和CDK9通過羧基末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）的磷酸化來調(diào)節(jié)RNA聚合酶II的活性[8]。它在RNA轉(zhuǎn)錄和延伸、細胞分化的調(diào)控以及其它細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。最近研究表明，CDK9 與艾滋病、心肌細胞肥大、血管生成、炎癥等疾病的發(fā)病過程有關(guān)，且CDK9在多種腫瘤的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[9,10]。

1994年，CDK9首次被發(fā)現(xiàn)，因為它具有Pro-Ile-Thr-Ala-Leu-Arg-Glu特征性而被命名為PITALRE[11]。PITALRE被確定為正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）的催化亞基，P-TEFb是一種蛋白激酶復(fù)合物，可在體外過度磷酸化RNA聚合酶II大亞基的CTD。有人將P-TEFb描述為新的CDK/細胞周期蛋白對，首次將其亞基命名為CDK9和Cyclin T。此后，鑒定出了Cyclin T1、T2a、T2b和K[12]。CDK9與Cyclin T1，T2a，T2b和K形成異源二聚體復(fù)合物。Cyclin T2a和T2b是同一個基因的兩種mRNA剪接產(chǎn)物，在其C端具有67個氨基酸[13]。CDK9在其所有組織中均普遍表達，其激活劑Cyclin T1、T2a和T2b細胞周期蛋白也如此[14]。而Cyclin K主要在睪丸，胃和骨髓中表達[15,16]。

自CDK9被發(fā)現(xiàn)以來，一直被人們認為是分子量約42 kDa的蛋白質(zhì)。然而2003年，研究人員鑒定出了一種新的同工型，該同工型是從同一基因的替代啟動子轉(zhuǎn)錄而來，比原始啟動子重13 kDa。自此CDK9同工型開始被命名為CDK942和CDK955[17]。研究表明，這兩種亞型均存在于HeLa，NIH/3T3人類巨噬細胞和小鼠肺和肝組織，但豐度不同。相關(guān)研究結(jié)果表明CDK942和CDK955同工型的表達受到差異調(diào)節(jié)，并且這兩種同工型之間的功能差異可能取決于其亞細胞定位、表達模式以及對底物獲取方式的不同。且CDK942和CDK955啟動子具有不同的活性和對激活信號的響應(yīng)[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CDK942在RNA轉(zhuǎn)錄和延伸、細胞分化調(diào)控等細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。而CDK955能與參與DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)Ku70特異性結(jié)合，但CDK942與這種作用不相關(guān)，表明CDK955可能在DNA的修復(fù)中起作用[19]。這些結(jié)果表明，盡管尚未在文獻中對其進行具體表征，但應(yīng)區(qū)分這兩種同工型的功能。

2 CDK9的作用機制

CDK9不是典型的Cdc2樣激酶，不參與細胞周期調(diào)控過程。相反，它在轉(zhuǎn)錄過程中起作用。CDK9是轉(zhuǎn)錄CDKs亞家族的重要成員，該家族是一組激酶，其功能是控制真核RNA聚合酶II合成和加工mRNA的主要步驟[20]。作為細胞周期蛋白依賴性激酶，體內(nèi)CDK9激活取決于其與Cyclin T的結(jié)合，以組裝P-TEFb。雖然有其他能夠使CTD磷酸化的細胞周期蛋白依賴性激酶，但是唯一以催化劑方式激活基因表達的激酶是CDK9。因此，Cyclin T /CDK9是一種在轉(zhuǎn)錄中起作用的專用激酶，而在體內(nèi)CTD是該復(fù)合物的主要功能靶點[21]。盡管CDK9的基本機制很復(fù)雜并且尚未完全闡明。

RNA聚合酶II負責真核生物中蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄，與所有其他RNA聚合酶的不同之處在于，其最大的亞基包含一個CTD，該域由七肽重復(fù)序列和YSPTSPS共有序列組成[22,23]。CTD的磷酸化與轉(zhuǎn)錄循環(huán)中的各個步驟相關(guān)。次磷酸化的RNA聚合酶II被募集到轉(zhuǎn)錄起始位點，并形成預(yù)起始復(fù)合物。

CTD的磷酸化位點數(shù)量超過50個，絲氨酸是其主要的磷酸化位點[24]。而由CDKs對CTD進行磷酸化的主要有2種：一種是CDK7磷酸化的Ser5（YSPTSer5PS）[25,26]，另一種是CDK9磷酸化的Ser2（YSer2PTSPS）[27]。首先，CDK7磷酸化Ser5，從而激活RNA聚合酶II，Ser5磷酸化的RNA聚合酶II能夠刺激RNA的轉(zhuǎn)錄，但不是其延伸過程[28,29]。P-TEFb對Ser2的磷酸化作用促使RNA轉(zhuǎn)錄的延伸。因此，P-TEFb對在細胞中產(chǎn)生成熟的mRNA是必不可少的。

CDK9的活性取決于與Cyclin T的結(jié)合，并通過與其他大分子的結(jié)合而進一步受到調(diào)節(jié)。這些調(diào)節(jié)劑包括激活劑，例如c-myc，NF-κB，雄激素受體，Brd4 或超伸長復(fù)合物的亞基和抑制蛋白復(fù)合物，例如含有復(fù)合物的抑制性7SK小核RNA（7SK snRNA）[30-33]。CDK9的激酶活性失調(diào)與多種人類病理狀況有關(guān)，例如過度增生性疾?。ɡ绨┌Y），以及病毒引起的傳染病和心血管疾病。PTEFb介導(dǎo)的短壽命抗凋亡生存蛋白的轉(zhuǎn)錄，Mcl-1等癌基因和c-MYC等癌基因在癌細胞的生長和存活中起著至關(guān)重要的作用。另外，這些蛋白質(zhì)在對化學(xué)療法的抗性發(fā)展中顯示出重要的功能。抑制CDK9會導(dǎo)致這些重要的生存蛋白和癌基因的短壽mRNA轉(zhuǎn)錄本迅速耗盡。因此，選擇性暫時抑制排他性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CDK9是癌癥治療中一種有希望的新方法[7]。

3 CDK9抑制劑的研究進展

對小分子的研究是發(fā)現(xiàn)靶向癌癥治療成功藥物的基礎(chǔ)。CDK9是許多癌癥的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和潛在治療靶標。多種非選擇性CDK9抑制劑已在臨床上取得進展。本文中，我們總結(jié)了一些被設(shè)計為具有CDK9抑制作用的抗腫瘤藥物的小分子以及相關(guān)臨床研究的進展。

3.1 非選擇性CDK9抑制劑

3.1.1 Flavopiridol

Flavopiridol是一類天然黃酮類化合物，它是第1個被發(fā)現(xiàn)的CDK9抑制劑，也是最先進入臨床研究的CDK9抑制劑。Flavopiridol抑制CDKs，CDKs控制細胞周期進程并磷酸化RNA聚合酶II的CTD[11]。其對CDK9抑制的效力最好，在復(fù)發(fā)性或難治性慢性淋巴細胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者中有很好的療效，其抗腫瘤活性似乎是CDK9介導(dǎo)的抗凋亡蛋白轉(zhuǎn)錄的下調(diào)，目前已經(jīng)是美國FDA指定用于CLL治療的孤兒藥。然而，F(xiàn)lavopiridol在Ⅰ，Ⅱ期臨床試驗中出現(xiàn)了很多不良反應(yīng)，如血小板減少、血栓、嗜中性白血球減少、疲乏等[34,35]。上述嚴重毒性的高發(fā)生率阻礙了其作為療法的臨床發(fā)展。

3.1.2 Dinaciclib

Dinaciclib是目前最先進的CDK9抑制劑，是一種有效的選擇性CDK抑制劑，抑制CDK2，CDK5，CDK1和CDK9的IC50分別為1，1，3和4nM[36]。目前處于針對CLL作為單一藥物的III期臨床試驗和針對不同血液惡性腫瘤以及某些實體瘤的II期臨床試驗中[37]。然而，其藥代動力學(xué)性能差，缺乏對CDK9的長時間抑制作用[38,39]。在三項涉及該藥的II期研究中，對治療沒有完全反應(yīng)，并且75-95%的患者遭受了不良反應(yīng)[2]。據(jù)報道其有幾種免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如中性粒細胞減少和白細胞減少。同 flavopiridol一樣，它也被賦予了CLL的孤兒藥地位。

3.1.3 SNS-032

SNS-032是CDK2，7和9的有效和選擇性抑制劑，IC50 值分別為48，62 和4 nM。SNS-032對CDK1和CDK4的敏感性較低，IC50分別為480 nM和925 nM。與Flavopiridol相比，SNS-032在抑制RNA合成和誘導(dǎo)細胞凋亡方面更有效，SNS-032的活性易于逆轉(zhuǎn)。在分子水平上，SNS-032誘導(dǎo)RNA聚合酶II的ser2和ser5去磷酸化，并抑制CDK2和CDK9以及去磷酸化CDK7的表達[40]。無論預(yù)后指標和治療史如何，SNS-032均可在體外有效殺死CLL細胞。研究表明，SNS-032在白血病和實體瘤中具有抗腫瘤活性[41,42]。對轉(zhuǎn)移性難治性實體瘤患者進行的I期臨床試驗研究表明，SNS-032具有良好的耐受性，對于口服給藥可能是可行的[43]。在I期臨床試驗中，SNS-032在晚期CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者中表現(xiàn)出適度的臨床活動[44]。但是和其他的非選擇性CDK9抑制劑一樣，SNS-032的不良反應(yīng)發(fā)生率高且較為嚴重[45]。

3.1.4 Seliciclib

Seliciclib已被證明是多種CDK的有效抑制劑，其對CDK1，CDK2，CDK5，CDK7，CDK9的IC50 值分 別 為0.65μM，0.7μM，0.2μM，0.49μM和0.79μM。Seliciclib對CDK4，CDK6和 其 他80多種其他激酶均不敏感或僅被弱抑制[46]。在腫瘤細胞中，Seliciclib誘導(dǎo)細胞凋亡，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員Mcl-1[47,48]。Seliciclib已在許多I期和II期臨床試驗中進行了測試，該藥物已用于治療約450名癌癥患者，并這些患者中顯示出約一半的抗癌活性。Seliciclib還已經(jīng)在I期試驗中與吉西他濱和順鉑聯(lián)用在非小細胞肺癌患者中進行了測試。Seliciclib還正在與晚期核實體瘤患者一起用核苷類似物Sapacitabine（CYC682）聯(lián)合治療進行臨床測試，并與EGFR抑制劑Erlotininb（Tarceva）聯(lián)合用于晚期實體瘤標志物[49,50]。

3.2 選擇性CDK9抑制劑

3.2.1 AZD4573

AZD4573是一種新型的，高效且高選擇性的CDK9抑制劑。其抗腫瘤活性在體外廣泛的癌細胞系以及體內(nèi)細胞系和患者來源的異種移植模型中得到了確定。它被證明在體外血液癌癥模型中廣泛地快速誘導(dǎo)細胞凋亡和隨后的細胞死亡，并且以劑量和時間依賴性的方式消耗Mcl-1，這是AZD4573誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的主要機制。目前正在I期臨床試驗中對患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者進行AZD4573的評估[51]。

3.2.2 atuveciclib

atuveciclib是第一種進入臨床試驗的有效且高度選擇性的PTEFb / CDK9抑制劑。該化合物在體外顯示出強大的PTEFb抑制活性和高激酶選擇性。 atuveciclib在小鼠和大鼠的急性髓樣白血病的人類異種移植腫瘤模型中均有效。該化合物在每日一次給藥以及間歇給藥方案后均具有活性，為優(yōu)化人類給藥方案的有效性和耐受性提供了寶貴的選擇[52]。

3.2.3 CDKI-73

CDKI-73是CDK9的高效小分子抑制劑。它顯示出對來自不同來源的多種癌細胞系的有效細胞毒性作用，但已證明對正常細胞的毒性較小。CDKI-73誘導(dǎo)caspase依賴性細胞凋亡，其后是CDK9和RNA聚合酶II ser2位點脫磷酸化。與正常的CD34+細胞相比，CDKI-73比泛CDK抑制劑Flavopiridol更有效，并且對原發(fā)性白血病細胞的選擇性超過200倍[53]。CDKI-73還通過與多種抗凋亡蛋白（例如Mcl-1，Bcl-2和XIAP）轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的機制顯示了與氟達拉濱的協(xié)同作用，這為治療CLL和氟達拉濱復(fù)發(fā)疾病提供了有前景的治療策略。此外，最近，Lam等人對A2780卵巢癌細胞的敲低研究表明，CDK9的下調(diào)通過Mnk-eIF4E軸影響了致癌翻譯[54]。

4 結(jié)語

CDK9是癌癥治療中不斷發(fā)展的目標。CDK9抑制劑在體外已顯示出良好的抗腫瘤活性。CDK9抑制劑也在臨床前模型中顯示出了廣闊的前景，目前已經(jīng)有有許多CDK9抑制劑被開發(fā)出來，其在單藥以及與其他抗癌藥聯(lián)用中臨床試驗顯示出較好的治療效果。但是由于大多數(shù)CDK9抑制劑對其他CDKs和酶缺乏選擇性，因而在臨床試驗中治療窗口狹窄，并具有嚴重的并發(fā)癥以及明顯的副作用。因此，可以預(yù)想高選擇性CDK9抑制劑的研發(fā)將為腫瘤提供極具潛力的療法。