張迪，陳宇婷，周亞寧，楊謙

(1.西安醫(yī)學院，陜西 西安；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安)

0 引言

2019年武漢首次發(fā)現的不明原因引起的肺炎，經病毒全基因組測序及病原核酸檢測發(fā)現本次肺炎病原體為冠狀病毒[1]，國際病毒分類學委員會將該毒命名為SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)[2]，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將SARS-CoV-2引起的疾病命名為COVID-19(coronavirus disease 2019)[3]。截至北京時間2020年3月8日17時，世界衛(wèi)生組織數據顯示，受COVID-19疫情影響的國家和地區(qū)數量已達101個，全球確診105586例，死亡3584例，其中重型和危重型占死亡人數的主要部分[4]。SARS-CoV-2與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)有一定的相似性，均能導致嚴重的呼吸道癥狀[5]。借鑒此前的嚴重急性呼吸綜合征(SARS)、中東呼吸綜合征(MERS)等治療經驗，并不能有效提高感染患者的生存率[6]。理論上，從治愈者的血液里獲得特異性抗體，就有可能幫助患者戰(zhàn)勝病毒，CP(Convalescent plasma，CP)治療COVID-19受到臨床工作者們的高度重視。國家衛(wèi)健委發(fā)布截至2020年2月28日，全國已采集544人次血漿，用于245例SARS-CoV-2感染患者的臨床治療，檢測的157例患者超過48小時的監(jiān)測，其中91例患者臨床指標和癥狀有所改善[7]。這為治療SARSCoV-2感染提供了一種新的選擇和希望，但目前缺乏高質量臨床試驗，人們傾向于認為CP是一種“經驗”療法。本文將冠狀病毒及CP信息、相關的動物實驗和臨床研究等情況進行全面綜述，供臨床參考。

1 冠狀病毒

冠狀病毒是一種有包膜的RNA病毒，可分為4個屬：α、β、δ和γ，其中α和β冠狀病毒已知可感染人類。有7種可引發(fā)人類疾病，包括：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV 和 MERS-CoV 和 SARS-CoV-2[8]。

1.1 SARS-CoV

2002年，廣東省出現了SARS，一種叫做SARS-CoV的病毒被確認為病原體[9]。研究表明感染患者的血清促炎細胞因子和趨化因子水平升高[10]。循環(huán)細胞因子(如TNFα、CXCL-10、IL-6和IL-8)水平的升高可能是SARS-CoV感染導致預后不良的原因之一[11]。嚴重SARS患者血清中促炎細胞因子 (IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ和 TGF-β)和趨化因子(CCL2、CXCL9、CXCL10和IL-8)水平高于單純SARS患者[10，12-14]。此外，早期的CXCL10和IL-2的誘導，以及隨后IL-6的高分泌和IL-10的缺乏被認為是導致SARS-CoV感染期間肺損傷的免疫病理過程的原因[13]。因此，SARS-CoV感染的臨床惡化可能是由病毒直接誘導的細胞病變效應和由高細胞因子血癥或“細胞因子風暴”誘導的免疫病理共同作用的結果[15]。

1.2 MERS-CoV

2012年，在一名死于呼吸衰竭的沙特男子的痰中發(fā)現MERS-CoV，由該病毒引起的疾病命名為中東呼吸綜合征(MERS)[16]。研究發(fā)現MERS-CoV能感染許多人類免疫細胞，包括樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞，MERS-CoV感染樹突狀細胞和巨噬細胞會導致持續(xù)穩(wěn)定地產生促炎性細胞因子和趨化因子，例如 TNF-α，IL-6，CXCL-10，CCL-2，CCL-3，CCL-5和IL -8[17-18]。這些細胞因子的促炎反應和免疫吸引能力會導致免疫細胞浸潤到受感染患者的下呼吸道，可觀察到嚴重的炎癥和組織損傷[18]。據報道，MERS-CoV還可以通過上調Smad7基因和成纖維細胞生長因子2(FGF2)的表達誘導腎和肺細胞凋亡[19]。

1.3 SARS-CoV-2

2019年武漢爆發(fā)的COVID-19，通過深度測序和病原學研究，測序顯示，SARS-CoV-2亞屬β 冠狀病毒[1]?；蛐蛄蟹治霰砻?，與SARS-CoV的核苷酸同源性為79.0%，與MERS-CoV的核苷酸同源性為51.8%[20]。初步研究分子模型顯示SARS-CoV和SARS-CoV-2受體結合區(qū)的結構相似性[21]。中國科研者們發(fā)現SARS-COV-2的刺突蛋白識別宿主細胞ACE 2后病毒大量復制[22]，進而激活CD4+T 細胞，增殖且分化多種促炎性細胞因子如：γ 干擾素、IL-6和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，GM-CSF 又可激活單核細胞進一步釋放IL-6和其他因子，形成“細胞因子風暴”，使患者病情發(fā)展為多器官功能衰竭、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)甚至死亡[23]。所以，T 淋巴細胞釋放的IL-6和單核細胞釋放的GM-CSF 可能是病毒誘發(fā)細胞因子風暴的關鍵步驟[24]。已有研究表明“細胞因子風暴”可能就是COVID-19患者病情轉為重癥、危重癥的原因[5]。研究顯示COVID-19重癥患者的IL-6水平明顯高于輕癥患者，CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、自然殺傷細胞水平低于輕癥患者，提示重癥患者可能出現明顯的免疫抑制[25]。而單核細胞發(fā)揮非特異性免疫應答，提示機體特異性和非特異性免疫之間的平衡被打破與病毒引起“細胞因子風暴”的機制可能有關。以上提示，免疫病理學也可能在疾病嚴重程度的發(fā)展中發(fā)揮相關作用[23]。

針對COVID-19治療尚缺乏特效藥物，基于SARSCoV-2與MERS-CoV、SARS-CoV結構相似性，借鑒以往應對SARS和MERS的治療經驗，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中推薦新增的的抗病毒藥物如：洛匹那韋/利托那韋、磷酸氯喹、阿比朵爾等藥物已用于臨床治療COVID-19，目前正在進一步臨床試驗[26]。疫苗為有效防控COVID-19的有效手段，尚處于研發(fā)階段，而研發(fā)新藥需要更長的時間[27]。值得一提的是，《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》適用于病情進展較快，重型、危重型病例的治療[28]。在有限的防控策略環(huán)境下CP療法是潛在解決方案。SARS、MERS及COVID-19致病機制雖不完全清楚，但感染者們的廣泛肺損傷均與血清促炎性細胞因子和趨化因子升高有關，且已有研究證實禽流感、SARS等多種感染性疾病的惡化與“細胞因子風暴”有關[29]?；剌斂祻突颊哐宓姆椒ň徑狻凹毎蜃语L暴”已獲得一定進展[23]。有研究表明從康復期患者獲得的血漿和抗體治療可作為主要療法[30]。SARS 期間，也使用了免疫調節(jié)的治療措施，包括靜脈注射免疫球蛋白及CP[30-31]。MERS 流行期間，韓國部分患者接受了CP、恢復期血清(CS)或來源于CP的高免疫球蛋白治療MERS，該方法安全且有可能降低死亡率[30]。這些研究表明CP治療COVID-19有很好的應用前景。目前，CP已應用于COVID-19患者，并取得了較好的效果[7]。

2 恢復期血漿

人類傳染病防治的被動免疫(Passive immunity，PI)及其相關的人工獲得性被動免疫的概念可以追溯到20世紀，當時從受刺激動物(尤其是兔和馬)的血清中尋找特異性抗體[32]。人類血液也被鑒定為抗體的來源[33]?；謴推谘褐破?Convalescent blood products，CBP)是一種可能的人類源性抗體來源，是指從已康復患者身上采集富含抗體的血液，經過處理后輸注給其他患者的治療方法，并對引起該疾病的病原體產生體液免疫。輸注CBP能夠中和病原體，最終導致其從血液循環(huán)中消失，屬于被動免疫的一種方法。不同的CBP被用于實現人工獲得的被動免疫：(1)恢復期全血(CWB)、CP或CS；(2)合并的人免疫球蛋白(Ig)用于靜脈內或肌肉內給藥；(3)高滴度人Ig；(4)多克隆或單克隆抗體。單采血漿目前是首選的治療方法[32]。1918年至1920年西班牙流感大流行期間進行的研究表明，使用CBP可能有效，并首次將CP確定為一種潛在的病毒感染治療方法[32]。

3 CP在動物感染模型應用的療效評價

有研究表明CP在某些傳染病動物模型中可以改善病毒感染者病情嚴重程度。Jincun Zhao[34]的研究中，通過轉導人二肽基肽酶受體(hDPP4)建立的MERS-CoV感染小鼠模型，將一定量感染MERS-CoV存活的駱駝血清于MERS-CoV感染前24小時腹腔內轉移至6～8周齡Ad5-hDPP4轉基因雌性BALB/c小鼠體內。在感染后第3天測量肺部病毒滴度。與未治療組相比肺部病毒滴度明顯降低(P＜0.05)且每個血清的保護能力與體外測定的中和滴度成正比。另外，感染后7天后進行組織學分析。在未經處理的樣本中觀察到多灶性支氣管周圍和血管周浸潤，出血和水腫，但在接收到MERS-CoV特異性駱駝抗體的小鼠中僅檢測到最少的細胞浸潤。這證明了MERS-CoV免疫駱駝血清在治療MERS患者中具有潛在的應用價值。魏強[35]的一項研究，以3歲SPF恒河猴為動物模型，實驗結果為實驗感染產生中和抗體，輸入SARS-CoV中和抗體的恒河猴體內，SARS-CoV復制得到一定程度的抑制，病理變化也比模型組輕。這表明CP治療在人類身上有潛在的用途。

然而，Chad E. Mire團隊[36]用九只恒河猴實驗性感染了扎伊爾埃博拉病毒(ZEBOV-Makona)，研究結果證明在病毒血癥發(fā)作時單獨使用恢復期血清不足以提供100%的抗致命ZEBOV感染的保護。中和抗體的被動轉移也是目前一大研究熱點，一項研究表明使用從康復動物中提取的免疫球蛋白組分治療非人靈長類動物的埃博拉病毒(Ebola Virus Disease，EVD)是有效的[37]。目前，缺乏針對COVID-19的動物感染模型研究，未來可能需要建立動物模型來研究COVID-19的發(fā)病機制，但動物模型的選擇及實驗設計存在多種困難，仍需進一步探索。

4 CP的臨床研究

4.1 CP治療埃博拉病毒

事實上，恢復期輸血或血漿輸注已在臨床應用超過100年[38]。諸多學者從未停止CP對疾病療效及安全等問題的探討。一項薈萃分析表明，在1918年流感流行期間，CP可能使得死亡率下降20%左右[39]。首次使用CP作為治療EVD的被動免疫療法是在1976年，當時一名感染埃博拉的實驗室工作人員輸了兩個單位抗EBOV抗體的CP(滴度至少為1:64)并存活下來[40]。在同一爆發(fā)期間，CP被用于剛果民主共和國一名感染EBOV的年輕婦女。該婦女接受了在與馬爾堡病毒密切相關的感染后幸存的人的血漿治療[41]。然而，《新英格蘭醫(yī)學雜志》發(fā)表的一篇關于幾內亞CP對埃博拉病毒病的安全性和有效性的研究。結果表明84例確診為EVD的患者輸注高達500毫升中和抗體水平未知的CP，與生存率的顯著改善無關，研究期間未觀察到與使用CP相關的嚴重不良反應[42]?？赡苁怯捎诟腥净颊呓邮艿难獫{中和抗體滴度不高造成的。

4.2 CP治療冠狀病毒感染

John 等[30]通過Meta分析系統(tǒng)性鑒定了32項SARSCoV感染和嚴重流感的研究，分析顯示，與安慰劑或不治療相比，CP和高免疫球蛋白治療后的總死亡率降低了75%(優(yōu)勢比，0.25；95% 可信區(qū)間，0.14-0.45；I2=0%)。并沒有發(fā)現嚴重不良事件或并發(fā)癥的證據。但大部分研究證據級別非常低，缺少對照組，存在中高風險偏倚，臨床及方法學異質性。SARS爆發(fā)期間香港威爾斯親王醫(yī)院130人感染[43]，G. Cheng等人[44]研究了當時作為一線藥物的利巴韋林和類固醇與恢復期血漿的回顧性比較，分析數據表明，盡管使用了利巴韋林和高劑量類固醇治療，與持續(xù)使用大劑量甲基強的松龍相比，對病情惡化的SARS患者而言，CP治療更有利。針對于MERS-CoV感染的患者，有研究表明如果在疾病發(fā)作后的兩周內給予抗病毒藥物而難以治愈的患者，應用CP已顯示出一定的療效[45]。Yaseen Arabi等人[46]制定了一項研究方案以調查CP治療MERS-CoV感染危重患者的可行性。在第一階段(CP收集階段)，探討從具有顯著抗MERS-CoV抗體滴度的供體收集CP的可行性。在第二階段，對MERS-CoV感染患者進行CP治療，這項研究可能為將來的隨機對照試驗提供參考。一項研究顯示給MERS患者進行CP輸注，可能會導致輸血相關性急性肺損傷(TRALI)，從而進一步加速患者的肺部表現[47]。

針對CP治療COVID-19，一項前瞻性研究收集了10例經實時病毒RNA檢測確診的重癥患者。將最近恢復的中性抗體滴度大于1:640的供體的200毫升CP輸注給COVID-19患者，研究顯示CP治療對嚴重COVID-19患者具有良好的耐受性，未見嚴重不良反應，與輸注CP前相比，淋巴細胞計數增加(0.65×109/L vs.0.76×109/L)和C反應蛋白減少(55.98mg/L vs.18.13mg/L)。影像顯示7天內肺部病變有不同程度的吸收，其中7例未檢測到病毒載量，臨床癥狀明顯改善，這些結果表明，CP治療嚴重COVID-19是希望[48]。截至2020年3月6日，中國已完成154例重癥患者的治療，臨床顯示出較好的療效[49]。韓國首次使用CP治療COVID-19的報告，兩例患者均接受洛匹那韋/利托那韋和羥氯喹治療，但均出現持續(xù)發(fā)熱、迅速加重的低氧血癥和ARDS的雙側肺浸潤。在輸注CP后，患者表現出氧合和胸部X光改善，炎癥標記物和病毒載量減少[50]。近期的《美國醫(yī)學會雜志》中，Roback JD等人報告了對5名重癥COVID-19患者輸注CP的初步研究結果，所有患者的臨床癥狀在輸注CP后約1周都有改善，輸血后1到12天之間，患者的中和抗體滴度增加，呼吸道標本的SARS-CoV-2檢測呈陰性，這為CP治療危重型COVID-19患者提供了支持性證據[51]。最近，美國食品和藥物管理局(FDA)已批準使用CP治療重癥COVID-19感染者[52]。Massimo等人根據意大利國情提出CP捐獻操作規(guī)程[53]。《ELSEVIER》期刊發(fā)表的一篇文章提出根據CP治療SARS、MERS及COVID-19顯示出的有限成功率，可以將CP治療COVID-19作為印度減少死亡率的短期解決方案[54]。據報道，英國國家醫(yī)療服務體系(NHS)血液與移植部門計劃從COVID-19康復者體內收集血液，以研究CP是否可以改善SARS-CoV-2感染患者康復的速度和生存機會[55]。這預示著CP治療COVID-19已受到全球關注。

5 結語與展望

目前為止大多數研究都是部分案例，只能提供可能的代表目標人群，也可能不代表目標人群的低質量科學證據。再者，CP主要用于危重癥患者治療[56]，危重癥患者本就存在營養(yǎng)及免疫失調，即使輸入正常未感染者血漿也會有改善癥狀的作用。值得一提的是，在設計關于使用CP的隨機臨床試驗方面需考慮到諸多問題，比如：評估幸存者成為CP捐贈者的意愿，需要充分選擇具有高中和抗體滴度的捐贈者，并確定重復CP捐贈有關的免疫、醫(yī)學或心理社會負面影響，關于其他傳染病原體傳播的風險，將感染傳染給輸血醫(yī)務人員的風險，如何確保CP中含有足夠的中和抗體，檢測到中和抗體時，是否仍存在持久性的病毒，使用單克隆抗體的免疫治療是否更有效等問題。CP試驗中的病死率不僅受患者風險因素的影響也有臨床中心提供的特殊支持性治療的影響，再者，需要關注接受CP治療的患者發(fā)生晚期不良事件的風險。由于許多未知因素(特別是中和抗體的進化)，療效難以評估。這引發(fā)了一系列問題，涉及流行病學、病毒學、免疫學、倫理、社會學等方面以及公共衛(wèi)生問題。即便這樣，在出現有效的、安全的、負擔得起的抗病毒藥物和開發(fā)有效的疫苗之前，CP的應用仍然有潛在的價值。然而，使用人血漿有潛在的風險，包括過敏性休克、輸血相關的循環(huán)過載和急性肺損傷(TRALI)[57]。盡管如此，CP療法仍然是科研人員關注的焦點，期待為疾病治療開辟新路徑。