徐超，楚天舒

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科二病區(qū)，云南 昆明）

0 引言

冠心病嚴(yán)重威脅人類生命、健康，具有高死亡率和高致殘率。我國冠心病患病率處于持續(xù)上升階段，帶來了沉重的社會及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)《中國心血管病報告2018（概要）》數(shù)據(jù)顯示全國冠心病患者1100 萬，2017 年冠狀動脈經(jīng)皮介入治療數(shù)超過75 萬例[1]。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療( percutaneous coronary intervention，PCI) 是冠狀動脈血管重建治療的轉(zhuǎn)折點，顯著改善冠心病患者預(yù)后，成為冠心病最有效的治療手段。但 PCI 術(shù)后存在支架內(nèi)再狹窄(instent restenosis，ISR) ，嚴(yán)重限制其臨床療效。據(jù)統(tǒng)計裸金屬支架植入術(shù)后ISR 的臨床發(fā)生率約為20%-35%，藥物洗脫支架的使用使ISR 的發(fā)生率降低到5%-10%[2,3]，如何預(yù)防及治療ISR 是當(dāng)前心血管領(lǐng)域亟待解決的問題。血管損傷及修復(fù)、血管重塑是ISR的重要機(jī)制?；蛟诩膊〉陌l(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的地位，研究表明非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）在血管損傷及修復(fù)、血管重塑等血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用，本文對 ncRNA 與ISR 相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述，ncRNA 的測定及靶向治療可能為ISR 防治提供新的思路和策略。

1 概述

ISR 發(fā)生于冠狀動脈粥樣硬化患者冠狀動脈成形術(shù)與支架植入術(shù)后，冠脈支架全程和/ 或兩端5 mm 節(jié)段內(nèi)管腔丟失，冠脈造影發(fā)現(xiàn)管腔狹窄≥50%，或血管內(nèi)成像發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的支架內(nèi)管腔≥75% 的狹窄并伴見相對應(yīng)的心肌缺血臨床表現(xiàn)[4]。血管成形術(shù)或支架植入導(dǎo)致病變血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞、內(nèi)部彈性纖維層斷裂，支架作為外源性物質(zhì)，通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和植入后新內(nèi)膜的形成等引起ISR 和晚期血栓形成。在動物模型和患者中觀察到再狹窄過程包括彈性回縮、血栓、新內(nèi)膜的形成和的血管重塑[5]。血管機(jī)械拉伸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）剝脫，ECs、炎癥細(xì)胞和血小板釋放各種細(xì)胞因子促進(jìn)新生內(nèi)膜層血管VSMCs 和成纖維細(xì)胞發(fā)生遷移和增殖，導(dǎo)致內(nèi)膜增生及血管重塑[6]。藥物洗脫支架雖有效抑制VSMCs 的增殖和遷移，但抑制損傷血管內(nèi)膜內(nèi)皮化，內(nèi)皮下膠原長時間暴露亦可導(dǎo)致晚期血栓形成[7]?？梢奦SMCs 和ECs 失衡在血管損傷及修復(fù)、血管重塑等血管疾病中起到關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致ISR的重要機(jī)制。

目前研究表明，人類大約只有2% 的基因組負(fù)責(zé)編碼蛋白質(zhì)， ncRNA 來源于“非編碼”基因組區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來的異質(zhì)類RNA 分子[8]。根據(jù)鏈的長短，主要分為小分子ncRNA(＜200bp)和 長 分 子ncRNA（＞200bp），前 者 包 括miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、snRNA（small nuclear RNA）、piRNA（piwi-interacting RNA）、tRNA（transfer RNA），后 者 包括rRNA（ribosomal RNA）、自然反義轉(zhuǎn)錄子、lncRNA（long noncoding RNA）[9]。大量研究表明ncRNA 是機(jī)體代謝、發(fā)育和分化等各種生理和生物學(xué)反應(yīng)的重要介質(zhì)，與機(jī)體的某些病理狀態(tài)有關(guān)，ncRNA 在血管功能障礙、再內(nèi)皮化和血管再狹窄中發(fā)揮重要作用，ISR 與ncRNA 的失調(diào)密切相關(guān)，本文主要集中討論研究較多的三類ncRNA：miRNA、lncRNA、siRNA 基因表達(dá)中起調(diào)控作用與ISR 的關(guān)系。

2 miRNA 與ISR

目前對miRNA 的研究較為廣泛，miRNA 由18-22 個核苷酸組成，在3’- 非翻譯區(qū)(3'-UTRs) 與靶基因結(jié)合，導(dǎo)致信使RNA的直接降解或通過補(bǔ)體進(jìn)行翻譯抑制，從而能夠調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[10]，大量miRNA 被確認(rèn)為多種疾病中基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可作為心血管疾病的生物標(biāo)志物[11]。在ISR 的發(fā)生、發(fā)展中，miRNA 對VSMCs 及ECs 功能調(diào)節(jié)上具有關(guān)鍵性作用。

Ji 等[12]首次利用miRNA 陣列測定大鼠球囊損傷后頸動脈miRNA 譜，在新生內(nèi)膜病變中測定到miR-21 的異常過表達(dá)，miR-21 通過直接靶向作用于磷酸酶和Tensin 同源蛋白促進(jìn)VSMCs 的增殖，后者是VSMCs 體內(nèi)和體外功能的關(guān)鍵調(diào)控因子。血管造影證實的ISR 患者體內(nèi)miR-21 循環(huán)水平明顯高于對照組，支持了miR-21 的調(diào)節(jié)在人類臨床中具有相關(guān)性的觀點[13]。Wang 等[14]人使用anti-miR-21 涂層支架測試局部遞送miR-21抑制劑對損傷動脈的影響，證明anti-miR-21 涂層支架在不影響再內(nèi)皮化的情況下顯著減少支架內(nèi)再狹窄。miR-143 和miR-145被認(rèn)為是血管發(fā)育和血管疾病中VSMCs 表型開關(guān)的主要調(diào)控因子[15]，miR-145 和miR-143 基因組消融可導(dǎo)致小鼠VSMCs 分化不完全，在控制VSMCs 足突形成中發(fā)揮作用[16]。臨床證據(jù)顯示，miR-143 循環(huán)水平能夠預(yù)測ISR 發(fā)生，miR-143/miR-145 強(qiáng)烈參與新生內(nèi)膜形成的分子機(jī)制[13]。研究發(fā)現(xiàn)miR-22 在受損股動脈中下調(diào)，通過靶向結(jié)合甲基蛋白、組蛋白去乙?；负突貧w病毒整合位點蛋白同源物的3'UTR，過表達(dá)可降低VSMCs 的增殖，抑制損傷股動脈的新生內(nèi)膜形成[17]。在大鼠模型中，觀察到球囊損傷頸動脈組miR-133 水平降低[18]，miR-133 表達(dá)降低VSMCs 的增殖和遷移，腺病毒介導(dǎo)的miR-133 過表達(dá)可減弱球囊損傷后的新生內(nèi)膜形成，而抑制其內(nèi)源性水平則可誘導(dǎo)相反的效果，冠狀動脈miR-133a 濃度梯度的降低預(yù)示著ISR 率更高[19]。miR-195 表達(dá)限制VSMCs 增殖、遷移，在周圍動脈疾病患者支架植入術(shù)2 年后，miR-195 循環(huán)水平是靶血管重建的獨立預(yù)測因子[20]。miR-9、miR-23b、miR-559 和miR-663 介導(dǎo)抑制血管增生疾病進(jìn)的一步例子，此外，miR-125b、miR-130a、miR-146a、miR-210 等其他miRNA 也參與調(diào)控VSMC 功能[21]。特別是miR-21、miR-100、miR-143 和miR-145 的循環(huán)水平與藥物支架植入后ISR 的發(fā)生有關(guān)，在ISR 患者循環(huán)中，miR-21 水平隨著miR-100、miR-143和miR-145 水平的降低而顯著升高。

ECs 具有維持血管正常生理功能、調(diào)節(jié)血管對剪切應(yīng)力變化的反應(yīng)重要作用，血管破裂區(qū)域的不完全覆蓋是動脈粥樣硬化和晚期血栓形成的主要原因，支架置入后腔內(nèi)ECs 的快速再生可預(yù)防ISR 和血栓形成[22]。miRNA 對ECs 具有潛在的調(diào)控作用。ECs 表達(dá)中miR-126 量最高，它參與炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)[23]。在小鼠模型中，miR-126 缺失使受損動脈ECs 再生障礙，導(dǎo)致血管完整性喪失和血管生成減少[24]。動脈粥樣硬化的早期階段炎癥細(xì)胞因子高表達(dá)，miR- 126 具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子和腫瘤壞死因子功能，主要信號通路包括通過抑制SPRED-1（出芽相關(guān)蛋白sprout-related protein）和PIK3R2（2 磷酸肌醇3 激 酶 調(diào) 節(jié) 亞 基2phosphoinositol-3 nase regulatory subunit）、以及 VCAM-1（血管細(xì)胞粘附蛋白1Vascular cell adhesion molecule 1）高表達(dá)[23,25]。miR-126 通過調(diào)節(jié)ECs 對脂質(zhì)的反應(yīng)改變ECs的轉(zhuǎn)化率發(fā)揮保護(hù)作用[26]，過表達(dá)促進(jìn)ECs 增殖來預(yù)防動脈粥樣硬化。miR-17/92a 被認(rèn)為是另一個關(guān)鍵調(diào)控因子，在冠狀動脈搭橋手術(shù)患者、缺血和血管損傷的動物模型中，其水平均升高[27]。miR-221/222 在體外抑制ECs 增殖和遷移，抑制新生血管形成[28]。最近研究表明miR-222 通過內(nèi)皮衍生的微顆粒傳遞，遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)粘附分子的表達(dá)，參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。

綜上所述，不同的miRNA 在調(diào)解VSMCs、ECs 功能相關(guān)的分子和通路中起到表觀調(diào)控作用，可以作為ISR 的重要早期標(biāo)志物，對miRNA 的調(diào)控可能對ISR 具有治療潛力。

3 lncRNA 與ISR

近年來lncRNA 的生物學(xué)功能引起了人們的廣泛關(guān)注。 LncRNA 是一大類由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄、異構(gòu)級不同的RNA 分子，鏈長大于200 個核苷酸。lncRNA 對基因調(diào)控的各個方面都有重要作用，如染色質(zhì)重構(gòu)、RNA 轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接等[30]。由于lncRNA 具有與DNA、RNA 和蛋白質(zhì)靶點相互作用的能力，在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。lncRNA 功能和表達(dá)的改變可以導(dǎo)致多種人類病理過程，越來越多的證據(jù)表明lncRNA 在血管重構(gòu)等疾病中起到關(guān)鍵性的作用。

最早的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在大鼠模型中通過介導(dǎo)Ang II 信號通路導(dǎo)致表達(dá)顯著改變，在VSMCs 增殖和內(nèi)膜病變發(fā)展中起到重要作用[31]。lncR ANRIL 的下調(diào)可增強(qiáng)CDKN2A/B（細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因）的表達(dá)，抑制VSMCs 增殖，該基因位點與以血管形成改變或重構(gòu)為特征的疾病相關(guān)[32]。Tang 等[33]發(fā)現(xiàn)VSMC 分化期lncR Gas5 作用于TGF-β/ Smad3（transforming growth factor β1，TGF-β1）信號通路，抑制Gas5 表達(dá)導(dǎo)致VSMC分化下調(diào)。lncR-p21 的下調(diào)p53 的活性抑制VSMCs 增殖[34]；lncR MEG3 可影響VSMCs 生存和遷移[35]；LncR-AK098656 表達(dá)上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、降低了收縮蛋白水平、促進(jìn)VSMCs 的增殖和遷移，AK098656 轉(zhuǎn)基因大鼠出現(xiàn)自發(fā)性高血壓、VSMCs 合成表達(dá)升高、動脈狹窄[36]；lncR-RNCR3 在小鼠和人類主動脈粥樣硬化病變中上調(diào)，RNCR3 的下調(diào)降低了ECs 和VSMCs 在體外的增殖、遷移，加速了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，RNCR3 具有動脈粥樣硬化保護(hù)作用，可用于動脈粥樣硬化相關(guān)血管疾病的治療[37]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)LncR ATG9B 在ECs 表達(dá)中富集，ATG9B 是一種反義lncRNA，與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3 或eNOS）基因部分重疊，在正常情況下ECs 中的表達(dá)較低，在缺氧后表達(dá)上調(diào)，ATG9B 能夠下調(diào)eNOS 的表達(dá)減少一氧化氮的生成，一氧化氮具有抗動脈粥樣硬化和抗血栓形成的特性[38]。另一類個反義lncR HIF-1AS 在不同的人體組織中表達(dá)，在急性心肌梗死患者中表達(dá)上調(diào)，HIF1A-AS1 促進(jìn)ECs 增殖和減少凋亡[39]。LncRNA MALAT1 在內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，與內(nèi)皮細(xì)胞功能、炎癥過程和血管生成密切相關(guān)[40]。同時發(fā)現(xiàn)lncRNA 與miRNA 之間的相互作用調(diào)節(jié)ECs 功能，LncRNA-p21 通過調(diào)控mirna - 13038 促進(jìn)ECs的增殖和抑制細(xì)胞凋亡[41]。

總之，隨著研究進(jìn)展不斷深入，lncRNA 在調(diào)控VSMCs 的表型、ECs 的增殖與凋亡等功能逐漸被人們知曉，lncRNA 在ISR 生物學(xué)機(jī)制中起到關(guān)鍵作用，為ISR 靶點治療提供新的希望。

4 siRNA

siRNA 是一類長度為20-25 個核苷酸的雙鏈RNA，通過與mRNA 結(jié)合并促進(jìn)其降解來抑制特定mRNA 的翻譯。雖然內(nèi)源性siRNAs 在極少數(shù)哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)，但它們可以通過多種轉(zhuǎn)染途徑被導(dǎo)入動物的細(xì)胞中，并能有效地產(chǎn)生靶向基因的特異性敲除。因此，siRNA 是研究基因功能和藥物靶點的重要工具。近年來，它也被認(rèn)為是治療再狹窄的治療策略之一。

整合素在細(xì)胞黏附和遷移中起著重要作用，Kindlin-2 是整合素聚集和激活的關(guān)鍵成分，因此，可以通過調(diào)節(jié)整合素來抑制VSMC 的活化和遷移[42]。Wnt 信號通路在VSMC 的細(xì)胞增殖、遷移、粘附和存活過程中起著不可或缺的作用[43]。利用siRNA 抑制Kindlin-2 可以阻斷Wnt 信號，抑制VSMC 的增殖和遷移[44]。間質(zhì)相互作用分子1 (STIM1)促進(jìn)生長因子誘導(dǎo)的VSMCs 增殖，而siRNA 抑制STIM1 可減弱冠狀動脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）增殖。此外，在頸動脈成形術(shù)動物模型中，特異性RNA 干擾沉默STIM1也可抑制再狹窄[45]。雖然這些結(jié)果還沒有在臨床實驗中得到證實，但為siRNA 預(yù)防支架植入后再狹窄提供了新方向。

5 ncRNA 在ISR 中臨床展望

近年來，ncRNA 從實驗室到臨床的轉(zhuǎn)化備受關(guān)注，在動物實驗或臨床試驗中，預(yù)防血管細(xì)胞增殖、內(nèi)膜增生和ISR 方面表現(xiàn)出較好的效果，具有很大的應(yīng)用潛力。隨著ncRNA 檢測、分析方法的不斷改進(jìn)，新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，在將來可以實現(xiàn)無標(biāo)簽、可靠、廉價和快速的檢測方法，進(jìn)一步推動臨床研究，循環(huán)ncRNA 作為診斷性生物標(biāo)志物。尤其是ncRNA 作為臨床生物標(biāo)志物具有特殊的優(yōu)勢：能夠反映了細(xì)胞內(nèi)生物過程的狀態(tài)，對跟蹤某一疾病背后的特定生物學(xué)過程或?qū)δ骋惶囟膊?、臨床綜合征的病因診斷、治療和預(yù)后有明顯影響。在支架植入前，可通過ncRNA 對ISR 風(fēng)險進(jìn)行預(yù)測，判斷患者ISR 的風(fēng)險高低，為選擇更為精準(zhǔn)的治療方案提供可靠指導(dǎo)。

同時，為克服藥物洗脫支架ISR 限制，提出基因洗脫支架設(shè)想，該支架不僅可以傳遞抗炎、抗血栓藥物，還可以攜帶miRNA、siRNA 等ncRNA。通過使用覆蓋ncRNAs 的支架控制易感區(qū)域基因的表達(dá)來限制ISR 的形成和發(fā)展，從而達(dá)到更好的預(yù)防、治療作用。為證明這一觀點，Akt1 siRNA 涂層支架的第一階段臨床試驗已被證明對ISR 有效，通過AKT1 siRNA 持續(xù)釋放到支架附近的位置，從而抑制VSMCs 的增殖并防止再狹窄[46]。ncRNA 洗脫涂層支架可能是避免植入后心血管損傷患者再狹窄的最有效策略。盡管ncRNA 在動物模型和臨床試驗中顯示出潛在的益處，但關(guān)于ncRNA 在血管重構(gòu)機(jī)制中所起作用的實驗證據(jù)是最近才積累起來的，ncRNA 生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚、是否會帶來基因副作用等問題需要進(jìn)一步探索，此外，人類對心血管疾病的認(rèn)識很有限，因此，在心血管疾病患者中植入ncRNA 支架仍有很長的路要走。