張壯苗 張 巖

(三亞市人民醫(yī)院血液腫瘤科，三亞 572000)

肝癌為當(dāng)前最常見的惡性腫瘤之一，該病起病隱匿、術(shù)后易復(fù)發(fā)且對放化療敏感性均較差，總體治療效果仍有待提高[1]。近年來生物免疫治療在癌癥治療中的作用被逐漸發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前已知的最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，其能夠有效激活靜息期T細(xì)胞，同時促進(jìn)患者免疫功能的恢復(fù)、提高抗腫瘤能力，已成為腫瘤免疫治療的熱點[2]。

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)經(jīng)研究證實能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時與DC分化、T細(xì)胞功能以及腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)[3]。有研究證實SOCS1沉默能夠促進(jìn)DC抗原提呈、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能并且促進(jìn)IFN-γ以及TNF-α的分泌水平[4]。同時，SOCS1拮抗物能夠顯著增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗腫瘤能力[5]。越來越多的研究表明miRNA以及基因在DC的發(fā)育、分化以及功能調(diào)控發(fā)揮重要作用[6]。如有研究發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠靶向CD40L基因進(jìn)而調(diào)控氧化修飾低密度脂蛋白刺激的DC的成熟以及炎癥因子的分泌[7]。此外也有研究證實抑制miR-148a能夠調(diào)節(jié)DC以及T細(xì)胞，可作為一種新的抗癌免疫治療的手段[8]。miR-618經(jīng)研究證實在甲狀腺癌以及前列腺癌中發(fā)揮抑癌因子的作用[9,10]，但是其在肝癌的發(fā)病中是否發(fā)揮作用尚未明確，我們通過生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-618與SOCS1存在結(jié)合位點，因此選定miR-618作為SOCS1的靶向miRNA，旨在進(jìn)一步探討其是否能夠影響肝癌DC免疫調(diào)控功能，同時探討其具體調(diào)控機(jī)制，希望為肝癌的免疫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000試劑盒、RPMI1640培養(yǎng)基、Gibco Opti-MEM培養(yǎng)基和NanoDrop-1000購自賽默飛世爾公司；pmirGLO質(zhì)粒購自ADDgene公司；質(zhì)粒提取試劑盒Sigma、雙熒光素酶試劑盒購自Promega公司；TransScriptⅡ Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒購自全式金公司；TNF-γ、IL-6和IFN-α ELISA試劑盒購自齊一生物科技(上海)有限公司；所有抗體均購自Abcam公司；HEK-293T細(xì)胞購自武漢普諾賽公司；TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀和UniCel DxI800全自動免疫分析系統(tǒng)購自貝克曼庫爾特公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；所有序列均由華大基因合成。

1.2方法

1.2.1DC誘導(dǎo)分離 采集我院58例肝癌患者外周血，通過淋巴細(xì)胞分離液離心得到外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，培養(yǎng)于RPMI1640全培基中(RPMI1640+10%胎牛血清+2 mmol/L-谷氨酰胺+100 U/ml 青霉素+100 μg/ml 鏈霉素+1 g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸鈉+5×105mol/L的巰基乙醇)。待培養(yǎng)至第3天換液，吸去原培養(yǎng)液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液和適量肝癌細(xì)胞裂解液作為抗原刺激物，置CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d左右使其分化成DC，但并未成熟。此時輕輕吸去含有IL-4和GM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)液，更換等量的含有IFN-α的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)置于5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，至第9天時可獲得成熟的DC。

1.2.2T細(xì)胞分離 取PBMC，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×107個/0.5 ml。融化凍存的尼龍毛柱，以5～7滴/min的速度放出Hanks液。用5 ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。將0.5 ml的PBMC懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即加0.2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管。在37℃、5%CO2飽和水汽CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使細(xì)胞與尼龍毛充分黏附。用5 ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫尼龍毛柱。洗脫液中含有純的T細(xì)胞。收集洗脫液并于2 230 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，去上清，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3DC細(xì)胞及T細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整其濃度為2×106個/ml。DC細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測：在每個流式細(xì)胞管中加入50 μl稀釋后的CD83-FITC或CD1a-PE。T細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測：在每個流式細(xì)胞管中加入50 μl稀釋后的CD3-APC、CD4-FITC或CD8-PE。隨后在各管中加入50 μl細(xì)胞(約4×107個細(xì)胞)，輕輕混勻后避光冰浴20 min。隨后于4℃下2 000 r/min離心 10 min，棄去上清，在細(xì)胞沉淀中加入500 μl PBS緩沖液輕輕吹洗，再置于4℃下2 000 r/min離心10 min，此步驟重復(fù)2次。最后400 μl PBS懸浮細(xì)胞沉淀上機(jī)檢測。Cellquest分析流式結(jié)果。

1.2.4雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miR-618與SOCS1靶向關(guān)系 設(shè)計SOCS1的野生型及定點突變的3′UTR 片段并交由華大基因合成，隨后分別克隆到含有熒光素酶報告基因pmirGLO上游。挑菌、測序后提純質(zhì)粒備用。miR-618 mimic和陰性對照序列(由賽默飛世爾合成)分別與野生型及突變型3′UTR片段按LipofectamineTM3000說明書兩兩共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4 h換液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收獲細(xì)胞。雙熒光素酶試劑盒和全自動化學(xué)發(fā)光儀檢測細(xì)胞相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.5細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將DC分為如下幾組：mimic NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含mimic NC脂質(zhì)體)、miR-618 mimic組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含miR-618 mimic脂質(zhì)體)、sh-SOCS1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含SOCS1 shRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)體)、sh-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染含shRNA NC質(zhì)粒的脂質(zhì)體)、miR-618 mimic+sh-SOCS1組(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染含SOCS1 shRNA和miR-618 mimic的脂質(zhì)體)，轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)步驟依據(jù)lipofectamin 3000說明書進(jìn)行。

1.2.6熒光定量PCR檢測DC中miR-618表達(dá) 按TRIzol試劑盒提取DC中總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，使用ND-1000測量260 nm和280 nm 下吸光值，對總RNA的質(zhì)量進(jìn)行鑒定及測定濃度。利用TransScript Ⅱ Green One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒一步完成RT-PCR合成及qPCR。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。使用實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，測定miR-618表達(dá)水平(上游引物：5′-GGGGAAACTCTA-CTTGTCCTT-3′,下游引物：5′-TCGTATCCAGTGC-GTGTCGT-3′)，相對表達(dá)水平以U6為內(nèi)參(上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTTGCGTGTCAT-3′)，引物序列由華大基因合成。采用溶解曲線評價PCR結(jié)果的可靠性，2-ΔΔCt法計算miR-618表達(dá)量。

1.2.7Western blot檢測SOCS1蛋白表達(dá) RIPA裂解液使用前5min加入PMSF，使PMSF終濃度為1 mmol/L。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，將適當(dāng)?shù)腞IPA裂解液加入DC中(2×107細(xì)胞中加入1 ml裂解液)并于冰上孵育5 min。裂解物于12 000 g、4℃下離心5 min。BCA試劑盒測定蛋白濃度并用去離子水調(diào)整，隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。含5%牛血清蛋白的TBST在搖床上室溫封閉1 h。棄去封閉液，加入鼠一抗SOCS1。GAPDH作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)膜后置于4℃冰箱過夜。次日，用TBST漂洗，加入稀釋后的山羊抗鼠IgG二抗，4℃孵育4～6 h后，TBST洗膜。PVDF膜與ECL液在室溫下反應(yīng)1 min。吸去液體，覆蓋保鮮膜，拍攝X光片，觀察結(jié)果。以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.2.8DC活化表面抗原檢測 于Falcon管中加入CD11c-FITC、HLA-DR-ECD、CD86-PE、CD4-APC，在各管加入含DC的培養(yǎng)液，在2 000 r/min下離心20 s，待DC被完全標(biāo)記后避光反應(yīng)20 min，隨后每管加入生理鹽水100 μl，充分混勻后2 500 r/min離心2 min，取細(xì)胞沉淀置于流式管，在5 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest分析流式結(jié)果。

1.2.9ELISA檢測DC上清液中TNF-γ、IL-6和IFN-α水平 離心3 000 r/min，20 min收集DC上清液，隨后分別根據(jù)TNF-γ、IL-6和IFN-α細(xì)胞因子試劑盒測定上清中TNF-γ、IL-6和IFN-α濃度。

1.2.10細(xì)胞劃痕實驗 使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm 1條，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個DC，待過夜鋪滿。使用時槍頭盡量垂直于背后的橫線劃痕，不能傾斜。PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，在孔板中央滴加少量分離得到的T細(xì)胞進(jìn)行遷移誘導(dǎo)。放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h取樣，拍照，計算遷移率。

2 結(jié)果

2.1CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞純度 流式細(xì)胞術(shù)檢測尼龍毛柱分離后的T淋巴細(xì)胞亞型情況。結(jié)果顯示(圖1)，含有T細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD3+的細(xì)胞約占93%，說明分離得到的T細(xì)胞純度較高。檢測其T細(xì)胞亞群情況，其中CD3+CD4+細(xì)胞約占35%，而CD3+CD8+T細(xì)胞約占49%。

圖1 T淋巴細(xì)胞亞群檢測情況Fig.1 Detection of T lymphocyte subsets

2.2DC細(xì)胞鑒定 經(jīng)過肝癌細(xì)胞裂解液處理后的DC，光鏡下可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象，聚集細(xì)胞多呈圓形，星形，細(xì)胞膜清晰且光滑。大多數(shù)細(xì)胞失去樹突狀外觀，少部分細(xì)胞周圍產(chǎn)生多個不等的突起，有的較長，但仍見梭形(圖2A)。CD1a和CD83分別為DC特異性和成熟的細(xì)胞標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CD1a+細(xì)胞比例約為92%，同時CD1a+CD83+細(xì)胞約占83%(圖2B)。

圖2 DC鑒別Fig.2 Identification of DCNote: A.Morphology of dendritic cells under inverted microscope;B.DC purity assay.

2.3DC中miR-618表達(dá)情況 在DC誘導(dǎo)第0、2、4、6、8天熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-618表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3)，在誘導(dǎo)0、2、4 d，miR-618表達(dá)無顯著變化，但經(jīng)肝癌細(xì)胞多種抗原刺激后，在第4天miR-618表達(dá)呈時間依賴性下調(diào)(P<0.05)。

圖3 DC誘導(dǎo)分化期間miR-618表達(dá)情況Fig.3 miR-618 expression during the induction of DCNote:Compared with 0 d,*.P<0.05；compared with 6 d,#.P<0.05.

2.4miR-618靶向下調(diào)SOCS1表達(dá) RNA22靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站顯示，miR-618與SOCS1存在多個結(jié)合堿基位點(圖4A)，與此同時，雙熒光素酶報告系統(tǒng)也驗證了它們之間的靶向關(guān)系(P<0.05)(圖4B)。此外，檢測miR-618過表達(dá)后，HEK-293T細(xì)胞中SOCS1表達(dá)情況，結(jié)果表明與mimic NC相比，SOCS1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(圖4C、D)。

圖4 SOCS1與miR-618靶向關(guān)系Fig.4 Targeting relationship between SOCS1 and miR-618Note:A.Binding sites between miR-618 and SOCS1;B.Luciferase activity of HEK-293T cells in each group;C.Protein bands of SOCS1;D.Relative expression of SOCS1 protein.Compared with HEK-293T cells co-transfected with mimic NC and SOCS1-3′UTR-WT,#.P<0.05；compared with mimic NC group,*.P<0.05.

2.5miR-618靶向下調(diào)SOCS1促進(jìn)DC活化 流式細(xì)胞術(shù)檢測成熟DC表面抗原CD11c、 HLA-DR、CD86、CD4的表達(dá)，結(jié)果表明(圖5)，與各組對照相比，miR-618 mimic組和SOCS1 shRNA組CD11c、HLA-DR和CD86陽性細(xì)胞顯著增多，但CD4陽性細(xì)胞無顯著變化。且miR-618 mimic+SOCS1 shRNA組CD11c、HLA-DR、CD86陽性細(xì)胞數(shù)目增多更為顯著(P<0.05)。

圖5 DC表面抗原分子的表達(dá)Fig.5 Surface antigens expression on DCNote:Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

2.6miR-618靶向下調(diào)SOCS1促進(jìn)DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α細(xì)胞因子分泌 結(jié)果表明(圖6)，與各組對照相比，miR-618過表達(dá)組和SOCS1沉默組TNF-γ、IL-6和IFN-α表達(dá)顯著上調(diào)，聯(lián)合組上述因子上調(diào)更加顯著(P<0.05)。

圖6 各組DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α水平Fig.6 Expression levels of TNF-γ,IL-6 and IFN-α in each group of DCNote:Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

2.7miR-618靶向下調(diào)SOCS1促進(jìn)DC遷移能力 劃痕實驗檢測T細(xì)胞誘導(dǎo)下的各組DC的遷移能力，結(jié)果顯示(圖7)，與各組對照相比，miR-618過表達(dá)組和SOCS1沉默組DC遷移能力顯著升高，miR-618 mimic+SOCS1 shRNA組更加顯著(P<0.05)。

圖7 各組DC遷移率比較Fig.7 Comparison of mobility in each group of DCNote: A.Cell scratch test results in each group at 0 h and 72 h;B.Migration rate in each group.Compared with control group of each treatment group,*.P<0.05.

3 討論

近年來表明研究DC為啟動、調(diào)控以及維持免疫應(yīng)答機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，基于DC的基因免疫治療在多種腫瘤相關(guān)的動物實驗以及臨床試驗中也取得了越來越多的成果[11-13]。本研究從DC基因免疫治療在肝癌中的應(yīng)用角度出發(fā)，探討了miR-618靶向SOCS1對肝癌患者DC表型以及功能的影響，結(jié)果表明miR-618能夠靶向抑制SOCS1進(jìn)而促進(jìn)肝癌患者DC活化，促進(jìn)免疫調(diào)控功能的提高。

首先本研究組發(fā)現(xiàn)，miR-618在DC誘導(dǎo)期間呈時間依賴性下調(diào)。前人的研究早就證實miRNA參與了DC的分化，同時與腫瘤的生長和免疫調(diào)控有關(guān)，將miRNA作為靶點進(jìn)而增強(qiáng)DC的免疫功能也被越來越多的應(yīng)用于癌癥的免疫治療中[14，15]。如有研究發(fā)現(xiàn)miR-128能夠通過靶向p38進(jìn)而增強(qiáng)DC介導(dǎo)的抗腫瘤免疫[16]。miR-618以往被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌以及前列腺癌等癌癥中發(fā)揮抑癌因子的作用[9,10]，但是其在肝癌中是否發(fā)揮作用以及具體的作用機(jī)制尚未明確。Rossato等[17]在關(guān)于系統(tǒng)性硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，相對于健康對照組，系統(tǒng)性硬化患者漿細(xì)胞樣DC中miR-618的表達(dá)顯著減少，miR-618可能是對系統(tǒng)性硬化患者免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要靶點。本研究進(jìn)一步探究了其在肝癌免疫中的作用并且發(fā)現(xiàn)其在DC誘導(dǎo)分化期間的表達(dá)變化。

本研究通過生物信息學(xué)靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)SOCS1與miR-618之間存在靶向結(jié)合位點。細(xì)胞因子是一種由細(xì)胞分泌的，能夠?qū)?xì)胞的生長、分化和增殖進(jìn)行調(diào)控的多肽小分子，其主要通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而實現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮[18]。SOCS家族為JAK/STAT信號通路的負(fù)性調(diào)控分子家族，研究證實其能夠調(diào)控DC以及巨噬細(xì)胞的活化，同時對于T細(xì)胞的生長和分化過程必不可少[19]。SOCS1是SOCS家族的重要成員，研究證實SOCS1能夠?qū)C活化過程中的IL-6，IL-12、TNF-α以及IFN-γ等細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)[20]。同時，SOCS1缺陷的DC能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。如Guenterberg等[21]在研究中表明，SOCS1缺陷的小鼠具有更高的IFN-α表達(dá)水平，其抗腫瘤免疫功能也顯著增強(qiáng)。以上研究均表明了SOCS1在DC功能調(diào)節(jié)以及抗腫瘤免疫中的重要價值。我們在本研究中也同樣證實了沉默SOCS1在肝癌免疫調(diào)節(jié)中的重要價值并且表明SOCS1功能的發(fā)揮受其靶向miRNA的調(diào)控。流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面抗原發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-618或沉默SOCS1能夠促進(jìn)DC活化且二者聯(lián)合效果更明顯，這也進(jìn)一步證實了miR-618靶向SOCS1參與了肝癌患者中DC的活化。T細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[22]。本研究通過ELISA法對各組促進(jìn)T細(xì)胞分化成熟相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-618或沉默SOCS1能夠顯著促進(jìn)DC中TNF-γ、IL-6和IFN-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。進(jìn)一步檢測各組DC的遷移能力發(fā)現(xiàn)miR-618過表達(dá)組和SOCS1沉默組DC遷移能力顯著增強(qiáng)且聯(lián)合組效果更顯著，說明了miR-618通過對DC進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而參與肝癌免疫。

綜上所述，miR-618能夠靶向抑制SOCS1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌患者中DC活化，增強(qiáng)其免疫調(diào)控能力，miR-618有望成為肝癌免疫治療中的一個重要靶點。