孫 鵬 李歡歡 王衛(wèi)芳 竇 瑤 周曉晶

(長春中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，長春 130117)

肝癌是最常見的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，其致死率極高[1]。尋找抗肝癌免疫中有效靶抗原是抗肝癌免疫的難題[2]。在腫瘤細胞裂解物(tumor cell lysate,TCL)中含有豐富的腫瘤相關抗原(tumor associated antibody,TAA)，因此腫瘤細胞內(nèi)所有抗原都可能是免疫攻擊靶點，從而引起作用更強的抗肝癌免疫反應[3，4]。但腫瘤抗原的免疫原性弱，研究者們嘗試了多種方法來提高TCL的免疫原性。常用的方法包括：用DC裝載 TCL、以HSP為佐劑等[5，6]。Dong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的HSP65能協(xié)助lewis肺癌的細胞裂解物誘導抗肺癌免疫反應。此外，人們也研究了含有胞苷酸-鳥苷酸的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)與肝癌細胞裂解物聯(lián)合應用的效果，CpG ODN是一種Th1型免疫增強劑，刺激機體產(chǎn)生Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12等，并且能夠輔助TAA產(chǎn)生CTL反應從而清除腫瘤細胞[8]。Dong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CpG1826能增強TCL的免疫原性，從而應用于人類HPV病毒永生化的腫瘤模型中。因此CpG ODN或許會輔助TCL誘導抗肝癌免疫。根據(jù)以上推測，我們將小鼠肝癌細胞H22的TCL與具有免疫刺激增強作用的C型CpG ODN聯(lián)合應用于小鼠原位移植性肝癌模型，研究其抑瘤效果及機制。

1 材料與方法

1.1材料 H22細胞株由本實驗室液氮冷凍儲存，為懸浮生長，使用含10%FBS IMDM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。純化的單鏈寡聚脫氧核苷酸購自日本TaKaRa大連分公司(OPC級，純度90%，HPLC級，純度99%)。IFN-γ、IL-17檢測試劑盒購自R&D System公司。本研究使用的CpG ODN序列如下：C274(5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′)，被溶于無菌PBS中，紫外分光光度計定量，檢測內(nèi)毒素<0.03 EU/mg，符合動物實驗要求，于-20℃ 冷藏備用。雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，18～22 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心。

1.2方法

1.2.1TCL的制備和鑒定 將生長狀態(tài)良好的H22細胞用PBS洗滌、計數(shù)后取適量細胞制成細胞懸浮液。將細胞懸液于37℃水浴和-70℃冰箱中反復凍融5次，期間震蕩混合20 s。用臺盼藍染細胞并于顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，保證沒有活細胞存在。將制備合格的 TCL 放于-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2小鼠原位移植性肝癌模型的建立 將 1×107個H22細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，1周后形成腹水。取腹水分離H22細胞并計數(shù)，以2×106個細胞注射于小鼠右后腿外側(cè)皮下。待腫瘤直徑 1 cm 左右分離腫瘤組織于冰冷無菌PBS中，顯微鏡下將瘤塊剪碎至直徑(1.2±0.2)cm，將瘤塊種植于小鼠肝臟。

1.2.3原位移植性肝癌接種及免疫 BALB/c小鼠隨機分為4組，每組10只。在-1 d每只小鼠肝內(nèi)接種肝癌組織，然后于0、7、14、21 d經(jīng)雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)引流區(qū)皮下分別注射PBS、TCL(2×106個/只)、CpG ODN(12.5 μg/只)和CpG ODN(12.5 μg/只)+TCL (2×106個/只)，監(jiān)測小鼠生存期。

1.2.4CTL殺傷實驗 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細胞并用TCL刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h時，加入小鼠IL-2(20 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后離心并計數(shù)。刺激后的脾細胞作為效應細胞， H22細胞作為靶細胞進行殺傷實驗。5×105個脾細胞稀釋后與靶細胞共同培養(yǎng)，效靶比分別為12.5∶1、25∶1及50∶1。4 h后收集細胞并用臺盼藍染色，于顯微鏡下觀察存活的細胞，體積較大的細胞為H22細胞并計數(shù)，每毫升中的細胞數(shù)=四象限中的細胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104，4個象限的細胞總數(shù)必須介于200～500個之間，而且細胞濃度要超過104個/ml。按以下公式確定CTL殺傷情況，CTL細胞毒性%=(靶細胞對照孔細胞數(shù)-實驗孔細胞數(shù))/靶細胞對照孔細胞數(shù)×100%。

1.2.5Th1型細胞因子的檢測 小鼠分組及免疫程序同1.2.3，于末次免疫后7 d，分離小鼠脾細胞并與TCL共同孵育24 h，收集刺激上清并用IFN-γ和IL-12檢測試劑盒檢測IFN-γ和IL-12的水平。

1.3統(tǒng)計學分析 所有結(jié)果應用 SPSS17.0 軟件進行分析，生存曲線用Kaplan-Meier方法繪制；腫瘤發(fā)生率用Fish檢驗進行比較。組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1CpG ODN與TCL聯(lián)合應用對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用 BALB/c小鼠肝內(nèi)接種瘤塊后，給其注射PBS、TCL、CpG ODN、CpG ODN+TCL，觀察小鼠生存期。結(jié)果如圖1B所示，與其他組相比CpG ODN+TCL組的小鼠生存期明顯被延長了(P<0.05)，到77 d各組小鼠的存活率分別是PBS組20%、TCL組20%、CpG ODN組10%、CpG ODN+TCL組80%。每只小鼠死亡后分離其腫瘤組織如圖1A所示，CpG ODN+TCL組小鼠10只有2只成瘤并且分別于接瘤后48 d和53 d死亡，其他8只小鼠均未成瘤，這8只小鼠直到77 d全部成活且狀態(tài)良好。而其他各組成瘤率均在80%以上，且相繼死亡。

圖1 CpG ODN+TCL對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of CpG ODN+ TCL against orthotopic-transplantated liver cancer in miceNote:A.Tumors in liver from dead mice.PBS.dead/total=8/10,TCL.dead/total=8/10,CpG ODN.dead/total=9/10,CpG ODN+TCL.dead/total=2/10；B.Survival of mice with orthotopic-transplantated liver cancer.*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.2CpG ODN協(xié)同TCL誘導小鼠脾細胞增殖反應 BALB/c小鼠被隨機分為4組，末次免疫后7 d，取小鼠脾，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠的脾較其他兩組明顯增大，見圖2A。分離脾細胞并計數(shù)，計數(shù)結(jié)果如圖2B所示，CpG ODN組及CpG ODN+TCL組小鼠脾細胞數(shù)分別是1.8×108個和1.78×108個，遠遠高于PBS組、TCL組的脾細胞數(shù)(P<0.05)，但二者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 CpG ODN協(xié)同TCL對小鼠脾的影響Fig.2 TCL adjuvanted CpG ODN induced response of spleen in miceNote:A.Morphology of spleens from three mice after 7 d of the last injection.Sizes of the spleens were compared based on the scale；B.Lymphocyte numbers in spleens from three mice.Each bar represents of lymphocyte number from spleens(down).*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05 vs TCL group.

2.3CpG ODN協(xié)同TCL誘導特異性CTL反應 殺傷結(jié)果如圖3所示，當效靶比為分別為25∶1和50∶1 時，來源于CpG ODN+TCL免疫鼠的脾細胞能裂解H22細胞，裂解率分別為48%和51%，而其他各組均無裂解效應(P<0.05)。

圖3 CpG ODN協(xié)同TCL誘導了CTL反應Fig.3 CTL respense induced by CPG PDN+TCLNote:*.vs PBS;#.vs CpG ODN;&.vs TCL.

2.4CpG ODN協(xié)助TCL誘導小鼠分泌Th1型細胞因子 結(jié)果如圖4所示，CpG ODN+TCL組與CpGODN組產(chǎn)生的IFN-γ 和 IL-12水平均較高，均為PBS組及TCL組的2倍左右(P<0.005)，且兩組間無差異(P>0.05)。

圖4 CpG ODN協(xié)助TCL誘導小鼠分泌Th1 型細胞因子Fig.4 Th1 biased cytokines induced by CPG ODN+TCL in miceNote:A.Levels of IFN-γ；B.Levels of IL-12.*.P<0.05 vs PBS group;#.P<0.05,vs TCL group.

3 討論

在TCL制備過程中本研究組發(fā)現(xiàn)其含有分子量不同的多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中一定有豐富的腫瘤抗原存在腫瘤抗原的免疫原性弱，不足以誘導產(chǎn)生特異性的腫瘤殺傷反應。而C型CpG ODN具有強大的免疫刺激作用，作為Th1型免疫佐劑可增強抗原的免疫原性，研究組也證實了其能夠協(xié)同TCL有效的抑制原位移植性肝癌的發(fā)生和延長小鼠的生存期。

本研究組推測CpG ODN與TCL聯(lián)用對小鼠原位移植性肝癌的抑制作用與CpG ODN能協(xié)助TCL誘發(fā)特異性細胞免疫反應進而殺傷腫瘤細胞有關。CpG ODN能通過以下途徑協(xié)同TCL產(chǎn)生特異性細胞免疫反應清除肝癌細胞。第一，本研究組另一個研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN能上調(diào)MHC Ⅰ分子的表達，從而促進TCL遞呈及交叉遞呈[10]。第二，CpG ODN通過刺激B細胞和pDC產(chǎn)生IL-12 和 IFN-γ，為TCL提供Th1免疫環(huán)境,促進CD4+T細胞分化為Th1 CD4+T 細胞，使CTL浸潤到腫瘤位點特異性清除腫瘤細胞。而且IL-12還能誘導T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，它能提高肝癌細胞的MHC分子和共刺激分子的表達，從而使肝癌細胞更容易被CTL識別和清除。本研究中，發(fā)現(xiàn)單獨使用CpG ODN或?qū)⑵渑cTCL聯(lián)用明顯促進了小鼠脾細胞增殖、促進了IFN-γ 和 IL-12的分泌，且兩者之間無差別，說明了CpG ODN有強大的免疫增強作用和促進Th1型細胞免疫反應作用。在進一步的CTL殺傷實驗中，CpG ODN能協(xié)助TCL殺傷肝癌細胞，說明CpG ODN促進的Th1型細胞免疫反應增強了TCL特異性腫瘤細胞殺傷反應。而單獨應用CpG ODN卻沒有這樣的作用，說明CpG ODN雖能具有免疫刺激作用，但在沒有腫瘤抗原存在的情況下CpG ODN的免疫刺激引起的非特異性抗腫瘤效應不足以抑制腫瘤細胞的生長，這也與在抑制腫瘤實驗中CpG ODN與TCL聯(lián)合有抑瘤效果而單獨使用沒有效果相統(tǒng)一。說明CpG ODN與TCL聯(lián)用的抑瘤效果是通過誘導了特異性細胞殺傷反應清除腫瘤細胞實現(xiàn)的，具體機制還需進一步研究。