孫衛(wèi)欣，薛婷，尹光浩#

1吉林省前衛(wèi)醫(yī)院藥學(xué)部，長春130012

2吉林大學(xué)第二醫(yī)院乳腺外科，長春1300410

1 乳腺癌的治療現(xiàn)狀

全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已經(jīng)成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。近年來，亞洲地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展及抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)，乳腺癌患者的生存情況得到顯著改善。但是，TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期的原發(fā)乳腺癌患者的10年復(fù)發(fā)率仍約為5.8%，其中，大多數(shù)患者的復(fù)發(fā)與原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥機(jī)制的產(chǎn)生有關(guān)。可見，乳腺癌患者對抗腫瘤藥物的耐藥問題嚴(yán)重制約著其治療效果。

乳腺癌的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在組織學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及治療效果等方面，而此種異質(zhì)性尚不能通過組織病理學(xué)、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)受累數(shù)目及腫瘤標(biāo)志物等臨床相關(guān)參數(shù)得到精確的評估。乳腺癌在不同個體中呈高度異質(zhì)性[2]，而很多新技術(shù)、新療法在Ⅲ期臨床試驗階段又到達(dá)了瓶頸期，因此，如何建立更加有效的臨床前模型并推動抗腫瘤藥物的研發(fā)成為了現(xiàn)階段乳腺癌領(lǐng)域亟待解決的問題。

目前，普遍提倡通過對基因組醫(yī)學(xué)和藥物基因組學(xué)的研究為患有相同疾病的不同患者亞群個體化治療方案的制訂提供更加可靠的理論依據(jù)?；颊邅碓茨[瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型能夠保持其原始樣本的分子異質(zhì)性，為研究出更加有療效的抗腫瘤藥物提供了強(qiáng)有力的工具。PDX 的潛在應(yīng)用非常廣泛，包括新的治療靶點的識別、最佳治療方案的制訂、化療效果的分析和藥物組合的臨床前評估，以及生物標(biāo)志物的識別和新的耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)[3]。對這些特征的探索有利于對惡性腫瘤進(jìn)行更深入的研究，使前期實驗更加契合臨床真實事件[4]。

2 乳腺癌體外模型的建立與優(yōu)化

幾十年來，生物學(xué)家一直采用腫瘤單細(xì)胞層體外培養(yǎng)的方式從培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中提取小鼠異種移植物進(jìn)行生物學(xué)特征的研究[5]。然而，數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞株的生長與其實際來源腫瘤的增殖方式存在很大差異。在細(xì)胞傳代的過程中，由于應(yīng)用大量培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)改變和細(xì)胞系污染等事件的情況時有發(fā)生[6]。此外，連續(xù)細(xì)胞系在代數(shù)增加的同時，在細(xì)胞表型、細(xì)胞功能以及對疾病模型的反應(yīng)機(jī)制等方面出現(xiàn)了與原代細(xì)胞完全不同的情況。因此，細(xì)胞系是無法如實反映符合人類腫瘤微環(huán)境的變化的，特別是在某些通路和疾病功能的研究中，細(xì)胞系實驗的缺點逐漸暴露。細(xì)胞培養(yǎng)模型中基因表達(dá)的模式越來越單一，表明腫瘤一旦從患者體內(nèi)被取出，脫離了正常的生長環(huán)境，轉(zhuǎn)而在實驗室中培養(yǎng)，其異質(zhì)性就會消失[2]。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，選擇性壓力使分化程度最低的細(xì)胞得以生長，因此，經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，大多數(shù)細(xì)胞系已適應(yīng)了體外環(huán)境，產(chǎn)生了與人類不同的異質(zhì)性，在遺傳學(xué)和表型上與其起源細(xì)胞均大有不同[7]。為了更好地構(gòu)建人體腫瘤原本的生長環(huán)境，盡可能地保留腫瘤自身的特征，人們提出了PDX 模型這一概念。其實，早期PDX 模型的雛形是通過輻射或激素等干預(yù)方法從大鼠中獲得的人類表皮樣癌。此外，也可通過將人結(jié)直腸癌組織移植至裸鼠身上，利用動物模型研究惡性腫瘤。1987 年，加州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在裸鼠中建立了黑色素瘤的異種移植動物模型，改善了移植率低的問題。這些移植成功的模型均為抗腫瘤藥物療效的預(yù)測、靶向藥物的尋找奠定了基礎(chǔ)[8]。

目前，廣泛應(yīng)用于乳腺癌領(lǐng)域的細(xì)胞工具包括人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-435S 和MDA-MB-453 等[9-11]。但是，由于這些細(xì)胞系的無限傳代與培養(yǎng)，其表面的糖蛋白減少，細(xì)胞之間的黏著性降低，一些基因無法正常表達(dá)。

3 乳腺癌體內(nèi)模型

3.1 用于一線基礎(chǔ)研究的動物模型

3.1.1 T 淋巴細(xì)胞功能缺陷鼠 目前，BALB/c-nu

裸鼠已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的的實驗動物模型。此小鼠無胸腺，為免疫缺陷鼠，不能產(chǎn)生T細(xì)胞。隨著年齡的增長，皮膚角質(zhì)層變薄，頭頸部皮膚失去彈性，生長發(fā)育速度逐漸變慢，雖然B 淋巴細(xì)胞正常，但其免疫功能欠佳。裸鼠自發(fā)腫瘤現(xiàn)象罕見，抵抗力差，容易患病毒性肝炎和肺炎。

3.1.2 B 淋巴細(xì)胞功能缺陷鼠 重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠是自發(fā)性的SCID 突變鼠系，T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的發(fā)育和成熟受到阻礙。但是，SCID 小鼠有正常的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，其外觀與正常小鼠相同。但是，SCID小鼠免疫器官的重量未達(dá)到正常小鼠的30%。SCID 小鼠是PDX 模型的良好宿主[12]。少數(shù)SCID 小鼠的免疫功能在青年期可出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，這與小鼠的年齡、品系、飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。SCID 小鼠易被感染，在高度潔凈的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境下可存活1 年以上。SCID 小鼠自發(fā)性T 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病率為15%左右，起源于胸腺，并可發(fā)生多部位轉(zhuǎn)移。

非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NODSCID）小鼠是基于SCID 小鼠而研發(fā)出的免疫缺陷鼠[13]。與SCID 鼠相比，其NK 細(xì)胞的活性較低，免疫恢復(fù)的概率更低。SCID 突變基因的純合影響了T、B 淋巴細(xì)胞的正常發(fā)育。NOD-SCID 小鼠既存在先天免疫缺陷，又缺乏T、B 淋巴細(xì)胞，適用于各種腫瘤組織的移植。但是，NOD-SCID 小鼠更易發(fā)生淋巴瘤，且存活時間較短。

3.1.3 重度免疫缺陷鼠 近年來，在NOD-SCID 小鼠的背景下敲除白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）受體基因得到了NSG 小鼠。與其他免疫缺陷鼠相比，NSG 小鼠的移植成功率最高，能夠接受更多的移植物。值得注意的是，NSG 小鼠還能實現(xiàn)人類免疫系統(tǒng)的重建，植入人類造血干細(xì)胞后，NSG 小鼠的外周淋巴組織可以產(chǎn)生人類T 細(xì)胞。

3.1.4 B、T 淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞功能缺陷鼠Beige（bg）小鼠是細(xì)胞活性缺陷的突變系小鼠，該品系為SCID 和Beige 基因突變小鼠。該小鼠的特點為自然殺傷細(xì)胞發(fā)育和功能缺陷，巨噬細(xì)胞活性降低，免疫抗腫瘤殺傷作用出現(xiàn)的時間較遲，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能缺乏，體液免疫減弱。該品系適用于免疫學(xué)研究，尤其是各種致病因子的應(yīng)用，但需要達(dá)到SPF 級小鼠培養(yǎng)的環(huán)境要求。

3.2 PDX 建立方法

3.2.1 組織移植 建立PDX 模型的常用方法是提取患者的腫瘤組織并移植在免疫缺陷鼠皮下。首先通過手術(shù)或活檢收集患者的原發(fā)腫瘤組織，將其用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，然后將無菌培養(yǎng)皿置于冰上，于培養(yǎng)皿中切成﹤1 mm3大小的塊狀。麻醉免疫缺陷小鼠，使用眼科剪剪開約0.5 cm 切口，使用器械將筋膜與皮膚分開，然后將腫瘤組織放入小鼠乳腺相應(yīng)的部位。這些處于移植階段的小鼠稱為F1 小鼠。當(dāng)腫瘤生長并達(dá)到直徑約1.5 cm 時，將F1 鼠的腫瘤組織移植到另一只免疫缺陷鼠上，方法同F(xiàn)1 移植過程，處于該擴(kuò)增期的小鼠稱為F2 小鼠。觀察腫瘤生長情況，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100～150 mm3時，腫瘤組織可用于下游應(yīng)用[14]。

3.2.2 細(xì)胞懸液移植 細(xì)胞懸液移植指的是注射細(xì)胞懸液于移植部位，具體方法：將組織剪碎成大小為1～2 mm3的小塊，將組織研至勻漿；沖洗并收集細(xì)胞懸液，濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，離心沉淀，充分沖洗細(xì)胞后，用注射器吸取帶有基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞，并注射入皮下，其他步驟同上[15]。

3.3 體內(nèi)模型建立的影響因素

移植腫瘤時，腫瘤組織塊的大小與腫瘤細(xì)胞的成活率關(guān)系密切，組織塊過大會阻礙腫瘤細(xì)胞與生長環(huán)境的結(jié)合。同時，應(yīng)確保腫瘤組織的活力，避免移植入無效的腫瘤組織[16]。基質(zhì)膠可為腫瘤細(xì)胞起到提供營養(yǎng)、聚集細(xì)胞的作用[17]。因此，在移植過程中加入基質(zhì)膠會提高移植的成功率[18]。

腫瘤細(xì)胞離體的時間對于移植的成功率亦具有重要影響。由于腫瘤組織離體后會處于缺血、缺氧的狀態(tài)，因此，會對組織和細(xì)胞的生長發(fā)育不利，進(jìn)而影響PDX 模型移植的成功率。因此，將腫瘤細(xì)胞收集后種植到小鼠皮下的時間不宜過長，一般應(yīng)在2～3 h 內(nèi)完成，并且需要外科醫(yī)師與研究者密切配合。

4 PDX 的優(yōu)勢與不足

4.1 優(yōu)勢

經(jīng)過長期的體外培養(yǎng)，傳統(tǒng)細(xì)胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX）的腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)了外環(huán)境，喪失了異質(zhì)性，獲得的實驗結(jié)果趨于同質(zhì)化[19]。然而，PDX 模型中，移植的標(biāo)本來自人體腫瘤組織，充分保留了腫瘤間質(zhì)和細(xì)胞成分，使腫瘤生長的微環(huán)境更接近原發(fā)瘤；通過患者自身的腫瘤組織構(gòu)建的PDX 模型能夠反映個體的差異，更接近患者的實際情況[20]，有助于研發(fā)出針對個體的抗腫瘤藥物和檢測出自身特有的生物標(biāo)志物；收集的標(biāo)本也可為今后的研究提供大量的參考。未經(jīng)過體外培養(yǎng)的PDX 模型穩(wěn)定地保留了原發(fā)瘤的遺傳特性、組織學(xué)和表型特征，實驗結(jié)果顯示臨床預(yù)見性更好[21-22]，通過腫瘤標(biāo)志物評估腫瘤情況，可用于測試抗腫瘤藥物的敏感性和預(yù)測患者的預(yù)后，實現(xiàn)腫瘤的個體化治療。

4.2 不足

各種數(shù)據(jù)及分析均表明PDX 模型的建立比長期建立的細(xì)胞系和標(biāo)準(zhǔn)異種移植物更符合臨床惡性腫瘤的表型，但是，PDX 模型并未廣泛應(yīng)用于實驗中，主要存在以下影響因素[23]。

成本是PDX 模型未廣泛應(yīng)用于臨床的一個主要問題。為了得到有效的結(jié)果，每個樣本需要移植大量的受體鼠，同時，腫瘤移植物僅能在小鼠體內(nèi)維持，與單純維持培養(yǎng)細(xì)胞株相比，其培養(yǎng)及傳代需要更潔凈的培養(yǎng)環(huán)境及專業(yè)的技能，大大增加了成本。另外，制模周期過長，一般需觀察3～6個月才能決定模型是否成功[24]。由于人和鼠為不同的物種，因此，物種間的差異依然會存在。小鼠的環(huán)境會逐漸取代原發(fā)腫瘤的生長環(huán)境。腫瘤組織在小鼠體內(nèi)傳代過程中的一些不可控因素也可能導(dǎo)致個別基因的改變而無法準(zhǔn)確反映患者的病情。

由于PDX 模型的構(gòu)建需要免疫缺陷動物，而對免疫調(diào)節(jié)藥物或通過免疫功能激活的藥物研究就會限制此種模型的應(yīng)用[25]。乳腺癌PDX 模型的成功率較低又是當(dāng)前研究面臨的一個影響實驗進(jìn)程的重要因素，為了提高PDX 模型的成功率，移植過程中需要注意以下問題：①腫瘤自身因素，與其他腫瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX 模型建模更難。主要由于這兩種疾病的發(fā)生與激素水平有關(guān)。②實驗用鼠多為重度免疫缺陷小鼠。這些小鼠的免疫缺陷程度較高，可以保證相對較高的移植成功率，但也會為其他腫瘤的發(fā)生提供可能。③為了保證移植腫瘤的質(zhì)量，需要有經(jīng)驗的外科醫(yī)師判斷提取的是腫瘤細(xì)胞且無壞死組織。

5 小結(jié)與展望

近年來，關(guān)于PDX 模型應(yīng)用于乳腺癌的研究越來越多，Ramani 等[26]通過應(yīng)用三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）患者的PDX 模型對循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，PDX 腫瘤模型對于研究TNBC 具有重要意義。此外，Rosato 等[27]通過檢測人源化抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）單克隆抗體研究TNBC 患者PDX 模型的體內(nèi)活性，結(jié)果顯示，抗PD-1 抗體可顯著抑制部分PDX 腫瘤株的生長，并提高患者的生存率，表明PDX 模型在乳腺癌藥物的篩選中起到重要的作用，且應(yīng)用前景廣泛。

乳腺癌PDX 模型保存了原發(fā)腫瘤的分子特性、遺傳性和異質(zhì)性，為檢測和比較不同抗腫瘤藥物治療效果提供了高效、可靠的工具，有望進(jìn)一步推動乳腺癌臨床治療方案的優(yōu)化與革新[28]。

PDX 模型優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系異種移植模型，主要由于其與親代腫瘤有更多的相似之處[29]。目前，PDX 模型作為惡性腫瘤研究的可靠臨床前模型越來越被研究者們接受[30]，其維持了供體腫瘤的生物學(xué)特性，具有良好的臨床預(yù)測性。就目前的情況及數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，通過PDX 模型實現(xiàn)個體化治療還未達(dá)到實質(zhì)性的進(jìn)展，仍處于臨床驗證階段。因此，迫切需要更好、更具有臨床預(yù)測性的人類惡性腫瘤模型。有研究發(fā)現(xiàn)了另一種能反映人類惡性腫瘤的模型——人源腫瘤類器官模型（patient-derived organoid，PDO），研究者從人體中提取多能干細(xì)胞，通過短暫地低滲裂解紅細(xì)胞，計算細(xì)胞數(shù)量和生存能力。通過給予基質(zhì)膠等進(jìn)行極小的刺激，從而促進(jìn)其分化，并任其自由生長。這些細(xì)胞會自動根據(jù)種類分開，并排列成特定的空間構(gòu)型，經(jīng)過幾個月的培養(yǎng)，長成類似于人體器官結(jié)構(gòu)的“類器官”[31]。經(jīng)腫瘤組織培養(yǎng)出的“類器官”未來能夠更好地反映腫瘤的特點，可用于藥物反應(yīng)性試驗等研究。無論PDX 模型還是PDO 模型，都是通過改變動物模型的條件形成符合人類的腫瘤微環(huán)境，以對人類最小的損傷達(dá)到臨床最佳的效果。這些嘗試對乳腺癌新藥的研發(fā)及作用機(jī)制的研究均具有重要意義[32]，進(jìn)一步推進(jìn)了乳腺癌個體化治療的進(jìn)程，并促進(jìn)其研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化。