陳麗娜，王亞俊，莊 婕，丁會芹*

（1. 康立泰藥業(yè)有限公司，山東 青島 266112；2. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

腫瘤是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一[1-2]，其最基本和最普遍的主要治療方式仍為手術(shù)和放療、化療。但放療和化療在殺滅腫瘤細胞的同時，也會對正常組織細胞造成破壞，引起骨髓抑制及其并發(fā)癥如粒細胞、血小板減少等[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，白介素-12（inlerleukin-12，IL-12）能通過保護骨髓微環(huán)境或刺激其他細胞因子[4]，誘導長期造血重建干細胞增殖并向短期造血重建干細胞分化、成熟，再分化形成祖細胞，從而促進全血象的恢復，顯著提高生存率，其效果非常明顯。

國內(nèi)外均采用小鼠或猴作為實驗動物，用于放療、化療后血象恢復領(lǐng)域的研究。輻射導致的骨髓抑制較化療更為嚴重，呈全血象降低，尤以白細胞和血小板的降低顯著。動物各組織器官對輻射及化療藥物的敏感性不同，骨髓造血系統(tǒng)是最敏感的器官，其次是胃腸道系統(tǒng)。通過觀察動物死亡率、血象指標、免疫因子、血象谷值及其出現(xiàn)時間和持續(xù)時間等指標，評價IL-12在血象恢復和造血重建方面的藥效。

1 重組鼠源IL-12（rmIL-12）的血象恢復作用

1.1 rmIL-12的輻射防護效應

IL-12有刺激骨髓造血的功能，還能促進輻射小鼠的外周血象恢復，并能延長全身輻射損傷小鼠的生存期。接受致死劑量輻射的小鼠[5]，于輻射前48，36，24，12 h，及輻射后1，12，24，36 h單次靜脈注射rmIL-12，輻射前24 h和輻射后1 h給予IL-12的小鼠長期存活率（大于1年）分別為91.4 %和75 %，而對照組小鼠輻射后25 d內(nèi)全部死亡。評估照射后小鼠的骨髓病理學變化，發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組小鼠骨髓的細胞結(jié)構(gòu)均嚴重受損，而照射后第12天給藥組小鼠骨髓的造血細胞集落出現(xiàn)擴增，但對照組無此現(xiàn)象；第14天給藥組小鼠骨髓細胞結(jié)構(gòu)基本恢復至正常水平，而對照組小鼠骨髓仍然嚴重損傷，結(jié)果表明，IL-12有刺激骨髓造血的功能。

同時發(fā)現(xiàn)，rmIL-12還能促進輻射小鼠的外周血象恢復。致死劑量（10 Gy）照射后，rmIL-12治療組和對照組的外周血細胞計數(shù)（peripheral blood cell count，PBCC）在第12天下降至最低點，然后rmIL-12治療組小鼠的PBCC開始恢復，而對照組小鼠全部死亡；在亞致死劑量（5 Gy）照射組，rmIL-12給藥組顯著減弱了PBCC的降低，并加速了PBCC恢復。值得注意的發(fā)現(xiàn)是，IL-12促進了全血細胞恢復，包括白細胞、紅細胞和血小板。

另一項研究也表明[6]，照射后給予IL-12可延長全身輻射（total body irradiation，TBI）損傷小鼠的生存期。小鼠經(jīng)8 Gy TBI后24 h和72 h兩次皮下注射10 ng/鼠rmIL-12或安慰劑，實驗組小鼠30 d存活率為87.5 %，而安慰劑組小鼠30 d存活率僅為14 %。其后研究表明，單次注射IL-12也有良好的輻射防護作用：經(jīng)9 Gy TBI后24，48或72 h單次注射IL-12（30 ng/鼠）均能顯著延長小鼠的生存時間。與安慰劑組對比，IL-12給藥后動物存活率更高，且照射后24 h比48 h給藥能獲得更高的生存率。安慰劑組與照射后24 h給藥組的存活率有顯著的統(tǒng)計學差異。

不同輻射劑量的研究表明，IL-12增加生存率的作用不受小鼠輻射劑量的影響。受試小鼠接受3個不同輻射劑量TBI 24 h后，單次注射20 ng/鼠的IL-12均能顯著提高動物的存活率。8.6，8.8和9.0 Gy 3個輻射劑量照射后，安慰劑組的存活率分別為20 %、10 %和0，而給藥組的存活率分別為80 %，60 %和70 %。值得注意的是，增加輻射劑量后單次注射相同劑量的IL-12，小鼠的存活率基本相同，這意味著IL-12的功效并沒有因為輻射劑量的增加而降低。

病理學分析表明，IL-12能減輕輻射后小鼠骨髓和小腸損傷。經(jīng)8.0 Gy TBI 24 h后使用安慰劑或IL-12，輻射12 d后，安慰劑組小鼠的骨髓幾乎沒有造血再生跡象，而所有IL-12治療組小鼠骨髓表現(xiàn)出不同程度的造血重建，出現(xiàn)髓系祖細胞、巨核細胞和成骨細胞。以上研究數(shù)據(jù)表明，在免疫系統(tǒng)、骨髓和胃腸道等輻射損傷重疊時，IL-12對這3種對輻射敏感的組織均有緩解作用。

Basile等[7]構(gòu)建了兩種荷瘤小鼠模型，EL4淋巴瘤模型和Lewis肺癌模型，并分別給予放療和化療，研究IL-12對荷瘤小鼠血象恢復的作用。放療研究中，對荷瘤小鼠進行137Cs全身照射建模。rmIL-12分預給藥組、后給藥組及預-后給藥組，對照組為安慰劑（PBS）或粒細胞集落刺激因子（G-CSF）。中性粒細胞計數(shù)結(jié)果表明，淋巴瘤模型中的rmIL-12預-后給藥組第14天已達到正常水平，早于其他組。兩種腫瘤模型中，只有IL-12預-后治療組在早期（第7天）取得了顯著的紅細胞恢復效果。血小板計數(shù)結(jié)果表明，在第21天，所有rmIL-12治療組均表現(xiàn)出顯著的血小板恢復效果。同時相對于G-CSF治療組，第21天所有IL-12治療組產(chǎn)生具有統(tǒng)計學意義的顯著的血小板恢復效果?？傊瑹o論淋巴瘤還是肺癌模型，與G-CSF給藥組與對照組相比，IL-12預-后分劑量給藥組對每一種血細胞的造血恢復均有統(tǒng)計學意義的顯著影響。兩種腫瘤模型的小鼠腫瘤體積測量結(jié)果表明，IL-12同時明顯抑制了腫瘤生長。

1.2 rmIL-12對化療模型動物的血象恢復作用和聯(lián)合抗腫瘤作用

Basile等[7]向兩種荷瘤小鼠腹腔內(nèi)給予環(huán)磷酰胺建立化療模型。外周血細胞計數(shù)結(jié)果表明，除了淋巴細胞，兩種腫瘤模型的化療試驗均未觀察到明顯的骨髓抑制。但是，兩種腫瘤模型的血細胞抑制與恢復情況也有所不同。Lewis肺癌模型中，與安慰劑組相比第4天觀察到rmIL-12預-后給藥組和后給藥組紅細胞計數(shù)顯著增加。IL-12對血小板計數(shù)的影響的差異在兩種腫瘤模型中也均有顯著意義。EL4淋巴瘤模型中，與安慰劑組相比，IL-12后給藥組第8天的血小板計數(shù)顯著升高；與G-CSF組相比，IL-12后給藥組和預-后給藥組第8天的血小板計數(shù)升高也具有統(tǒng)計學意義。兩種腫瘤模型的化療研究觀察期結(jié)束時，IL-12聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療使得腫瘤體積顯著減?。?T/C＜50 %），而G-CSF治療均未實現(xiàn)顯著的腫瘤減少。同時，化療聯(lián)合IL-12給藥能明顯提高小鼠的無瘤率，在淋巴瘤試驗終止時，IL-12預-后給藥組和后給藥組分別有37.5 %和50 %的小鼠無腫瘤，而安慰劑組未發(fā)現(xiàn)無腫瘤小鼠。此項結(jié)果表明，IL-12在恢復造血功能的同時還表現(xiàn)出與化療藥物協(xié)同抗腫瘤的作用，而G-CSF的抗腫瘤作用卻并不明顯。

2 重組人源IL-12（rhIL-12）的輻射防護效應

2.1 rhIL-12對放射性輻射恒河猴的輻射防護效應

動物研究中[6]，恒河猴經(jīng)6.7 G y T B I（LD50/30）照射，rhIL-12在無任何支持性治療及抗生素治療情況下分單次或兩次給藥治療，結(jié)果表明，高低劑量rhIL-12單次或兩次給藥皆可降低致死劑量照射引起的死亡率。低劑量單次給藥組的生存率為71 %，其他治療組的存活率為75 %，安慰劑組的存活率是50 %。綜合以上結(jié)果，所有給藥組的存活率75 %，明顯優(yōu)于安慰劑組存活率50 %。

研究進一步分析輻照后的血細胞計數(shù)變化，12～14 d是血細胞極期，與對照組相比，rhIL-12給藥組極期白細胞數(shù)量、網(wǎng)織紅細胞數(shù)量及血小板數(shù)量均有顯著提高。同樣有這種明顯趨勢的還有中性粒細胞、嗜堿細胞和淋巴細胞，但是差異無統(tǒng)計學意義。

對所有死亡或被安樂死的受試動物進行器官病理分析發(fā)現(xiàn)，給藥劑量為100 ng/kg和250 ng/kg動物出血發(fā)生率均為12.5 %，安慰劑組的出血率為50 %。

Gluzman-Poltorak等[8]進行的一項隨機雙盲試驗中，恒河猴經(jīng)700 cGy TBI后24～25 h皮下注射單劑量的安慰劑（第1組）或劑量分別為50，100，250和500 ng/kg的rhIL-12（第2～5組），在治療過程中不給予任何抗生素、液體或血液輸注。結(jié)果表明，rhIL-12給藥組能明顯提高輻射動物的生存率。即在第60天時，1～5組的存活率分別是11 %，33 %，39 %，39 %和50 %，所有rhIL-12給藥組和對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。同時，通過檢測血小板、平均血小板容積、中性粒細胞、淋巴細胞及網(wǎng)織紅細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，rhIL-12對造血重建表現(xiàn)出很好的促進作用。

上述研究結(jié)果表明，rhIL-12可緩解輻射誘導的骨髓抑制。rhIL-12在減少嚴重中性粒細胞減少癥和嚴重血小板減少癥發(fā)生方面具有顯著作用，同樣淋巴細胞、中性粒細胞、血小板及網(wǎng)織紅細胞的降低程度也相應減弱。此外，與對照組相比，rhIL-12可提高平均血小板容積，表明rhIL-12可促進新生血小板從骨髓中釋放。

對骨髓再生區(qū)域數(shù)量和大小的定量分析同樣支持上述結(jié)論，即單獨使用rhIL-12即可刺激血細胞生成，使血液各成分恢復。rhIL-12給藥組骨髓再生區(qū)域的數(shù)量和面積均比對照組高，且rhIL-12各給藥組的升高程度較相似。與對照組相比，這兩個參數(shù)在500 ng/kg rhIL-12組中顯著升高。

對所有動物進行微生物學和病理學分析，心臟、腎臟、肝臟、雙肺、腦及脾臟的細菌學分析結(jié)果表明，rhIL-12治療組動物細菌生長比對照組更少。對照組血培養(yǎng)細菌陽性率是86 %，rhIL-12給藥組分別為65 %，65 %，47 %和44 %，250及500 ng/kg菌血癥的發(fā)生率明顯少于對照組（P=0.0072），統(tǒng)計各組所有器官的出血點及胃腸系統(tǒng)的出血點發(fā)現(xiàn)，對照組的平均出血點均高于各rhIL-12給藥組。

2.2 rhIL-12的輻射防護作用優(yōu)于G-CSF

一項隨機盲法試驗中發(fā)現(xiàn)[9]，恒河猴經(jīng)700 cGy致死劑量照射后24～25 h，皮下注射rhIL-12（175 ng/kg）可提高動物60 d后的存活率（rhIL-12組：56 %，對照組：36 %）。在對比研究組中，連續(xù)18 d給予G-CSF（每日10 μg/kg）的給藥組與對照組相比無生存率優(yōu)勢（G-CSF：31 %，對照組：36 %）。聯(lián)合用藥組單劑量給予rhIL-12并連續(xù)給予G-CSF 18 d后，動物的存活率為58 %，和rhIL-12單獨用藥組相比無統(tǒng)計學意義上的生存率提高（rhIL-12組：56 %）。

血液學方面，rhIL-12給藥組極期中性粒細胞、血小板和紅細胞計數(shù)均顯著提高，嚴重中性粒細胞減少癥和嚴重血小板減少癥的發(fā)生率也顯著減少，而G-CSF組發(fā)生率與對照組相當；G-CSF組動物在極期的粒細胞計數(shù)與對照組相比無優(yōu)勢，且G-CSF對血小板和網(wǎng)織紅細胞計數(shù)無改善。結(jié)果表明，rhIL-12單次給藥可促進骨髓再生，有恢復造血的功能，效果優(yōu)于連續(xù)用藥18 d的G-CSF。

骨髓病理評價，接受rhIL-12治療的動物與對照組相比，髓細胞和紅細胞數(shù)量有統(tǒng)計學意義上的顯著增高（P＜0.05），且數(shù)值高于G-CSF組。另外，與對照組相比，rhIL-12組成熟和不成熟的巨核細胞增多，尤其是成熟的巨核細胞更多。

研究分析了各組動物的感染、出血、黏膜炎和胃潰瘍情況。IL-12單獨給藥組和聯(lián)合用藥組與對照組及G-CSF組相比，感染率更低（rhIL-12組44 %，聯(lián)合用藥組46 %，對照組61 %，G-CSF組73 %），rhIL-12單獨給藥組的感染率明顯低于G-CSF組。另外，采用盲法評估60 d之內(nèi)死亡動物的出血得分，rhIL-12單獨給藥組也低于G-CSF組和對照組，聯(lián)合用藥組的出血點和對照組相當。與上述結(jié)果類似，胃潰瘍點也是rhIL-12單獨給藥組為最低，G-CSF組為最高。

此外，另一項研究發(fā)現(xiàn)接受輻射動物的存活率與血細胞谷值密切相關(guān)[10]。非人類靈長類動物照射（700 cGy）后24～25 h，單次皮下注射治療安慰劑（n=64）或rhIL-12（50～500 ng/kg；n=108），或連續(xù)注射G-CSF（每日10 μg/kg，n=26）18 d。血細胞分析顯示，各組（包括對照組、IL-12組和G-CSF組）所有幸存動物的淋巴細胞、中性粒細胞和血小板的極值中位數(shù)都顯著高于死亡動物（P＜0.001）。進一步動物死亡與血細胞低谷值（ROC，receiver operating characteristic）曲線分析顯示，淋巴細胞閾值0.08×109/L是強烈的死亡預測信號。中性粒細胞和血小板也是死亡預測的強烈信號，而紅細胞和網(wǎng)織紅細胞提供較少預測生存的信息。而所有動物無論各組單獨分析或綜合分析，其年齡、性別和體重均與血細胞極值和存活率無顯著關(guān)聯(lián)。這項研究意味著促進早期骨髓再生，使所有主要類型的血細胞谷值增加（尤其淋巴細胞、中性粒細胞和血小板），可能是rhIL-12減輕輻射導致重度骨髓抑制致死作用的主要機制。

3 rhIL-12的體外藥效研究

除上述體內(nèi)動物試驗外，還有許多文獻報道通過外周血或骨髓血單個核細胞集落形成試驗，對IL-12的體外藥效展開研究。

研究正常人外周血或骨髓血單個核細胞對IL-12的體外藥效發(fā)現(xiàn)，在其他細胞因子如rhIL-3、EPO或G-CSF等存在的情況下，聯(lián)合使用rhIL-12能明顯增加細胞集落數(shù)[11-12]。Jacobsen等[13]研究表明，集落培養(yǎng)試驗中，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3（FLT3）與IL-12或IL-11聯(lián)合可明顯刺激小鼠骨髓造血祖細胞的體外擴增。

關(guān)于IL-12刺激造血作用的機制，有種觀點認為IL-12通過γ干擾素（IFN-γ）發(fā)揮作用。有研究[14]提出IL-12通過Stat4途徑產(chǎn)生IFN-γ，進而作用于造血干細胞。雖然已普遍認為IFN-γ在造血方面有重要作用，但其具體作用機制目前還不明確，體外研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ對造血系統(tǒng)存在兩種截然相反的作用：（1）抑制作用。體外試驗結(jié)果表明[15]，IFN-γ對CD34+細胞的集落培養(yǎng)有明顯的抑制作用，且有劑量關(guān)系。Zoumbos等[16]用健康志愿者和再障患者的骨髓血單個核細胞進行集落培養(yǎng)試驗，用IFN-γ抗體處理后，集落數(shù)量明顯增多，尤其是再障患者的骨髓血單核細胞，從側(cè)面證明IFN-γ對骨髓造血有抑制作用。（2）促進作用。Zhao等[17]用體內(nèi)和體外試驗同時證明了IFN-γ能誘導Lin-Sca-1+C-Kit+（LSK）細胞的擴增。對野生型小鼠進行IFN-γ刺激后，LSK的比例與對照組相比明顯升高；而IFN-γ受體缺陷型和Stat1缺陷型小鼠，IFN-γ處理組LSK比例無升高。Caux等[18]采用體外培養(yǎng)試驗證明了IFN-γ能增強IL-3對人CD34+造血祖細胞的增殖作用。IFN-γ與IL-3聯(lián)合使用，與單獨使用IL-3相比，CD34+造血祖細胞的增殖明顯升高。但同時也發(fā)現(xiàn)，長期培養(yǎng)時，IFN-γ聯(lián)合IL-3對CD34+造血干/祖細胞有抑制作用，而單獨使用IL-3則不會抑制。

結(jié)合早期臨床研究分析認為IL-12的毒性與IFN-γ的過量生成有關(guān)，這意味著IL-12造血作用可能與其劑量有關(guān)，低劑量的IL-12可促進造血，而高劑量的IL-12刺激產(chǎn)生過多的IFN-γ抑制造血，并產(chǎn)生毒性反應。同時，上述文獻中研究結(jié)果的不統(tǒng)一也可能是由使用的試劑不同、試驗中添加的生長因子不同、乃至細胞不同造成的。

4 結(jié)語

綜上，國內(nèi)外研究均證實IL-12對重度放射損傷所致全血細胞減少癥具有很好的治療作用，能刺激骨髓造血早期恢復，減少出血及感染發(fā)生，并能顯著提高動物的生存率[19-22]。我國癌癥治療壓力逐年加大，放、化療能直接殺傷或控制腫瘤細胞，因而在臨床上得到廣泛應用。但由于放化療特殊的治療方式導致其對正常組織產(chǎn)生毒性，其中血液學毒性的發(fā)生率高，經(jīng)常導致患者因造血功能抑制而中斷治療，這種造血功能抑制表現(xiàn)為造血組細胞及多系血細胞同時減少，最為明顯的是粒細胞和血小板。鑒于IL-12明確的療效、極高的臨床價值、較低的風險，IL-12藥物的開發(fā)對腫瘤患者放、化療后血細胞減少的治療具有重大意義，有可能成為打破傳統(tǒng)血象恢復領(lǐng)域局限性的重磅藥物。