趙偉光，劉志宏

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海200080

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）及腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、免疫細胞等在內(nèi)的多種細胞成分組成。研究[1]認為，TME 在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、代謝、免疫抑制及藥物抵抗等方面發(fā)揮重要作用。

CAFs 是處于活化狀態(tài)的一類異質(zhì)性細胞，可來源于組織中靜息狀態(tài)的成纖維細胞、周細胞、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），或通過上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、內(nèi)皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）而來。與正常成纖維細胞相比，CAFs 具有明顯不同的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性。作為TME 的重要組成部分，CAFs能夠分泌大量可溶性分子，以旁分泌的方式作用于TME中的其他細胞[2]。TME 的另一大細胞群——免疫細胞與CAFs 協(xié)同作用，使TME 呈現(xiàn)為免疫抑制微環(huán)境，為腫瘤細胞的生長及免疫逃逸提供了有利條件[3]。因此，大量研究開始關(guān)注于CAFs 在誘導(dǎo)腫瘤起源及調(diào)控腫瘤免疫中所扮演的角色，并試圖以CAFs 為靶點找到治療腫瘤的新策略。該文就CAFs 參與腫瘤免疫炎癥微環(huán)境的分子機制及靶向CAFs 的免疫治療做一綜述。

1 CAFs 的分子標志物

1.1 α-平滑肌肌動蛋白

α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是CAFs 常見的分子標志物。其通過微絲束和應(yīng)力纖維調(diào)節(jié)成纖維細胞收縮，在傷口愈合中發(fā)揮重要作用。根據(jù)α-SMA 表達量的不同，?hlund 等[4]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中存在FAP+α-SMAhigh的肌性CAFs（myofibroblastic CAFs）和α-SMAlowIL-6high的炎性CAFs（inflammatory CAFs）。由于肌成纖維細胞在腫瘤組織中的含量更高，α-SMA 被廣泛用于標記CAFs[5]。

1.2 成纖維細胞活化蛋白

成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶家族的一員。傳統(tǒng)觀點認為，F(xiàn)AP 與組織修復(fù)、纖維化及ECM 降解有關(guān)。已有證據(jù)表明，F(xiàn)AP 在90%以上的上皮腫瘤中高表達[6]，因此，大量的研究將FAP 作為CAFs 的分子標志物。然而Li等[7]通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP 只在一些特定的CAFs 亞群中表達，在另一些亞群中則完全不表達。這一現(xiàn)象可能與CAFs 來源的異質(zhì)性有關(guān)。

1.3 其他

由于CAFs 具有高度異質(zhì)性，目前尚缺乏特異性的分子標志物。微纖絲相關(guān)蛋白5（microfibril-associated protein 5，MFAP5）、膠 原 蛋 白α-1（Ⅺ）鏈（collagen type Ⅺ α-1 chain，COL11A1）、肌腱蛋白C（tenascin-C，TN-C）等雖然可用于標記CAFs，但較少使用；血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、波形蛋白（vimentin）廣泛表達于成纖維細胞，也有研究將其用于CAFs 的標記[8]。與α-SMA 不同，F(xiàn)AP和PDGFR 表達在細胞表面，可用流式細胞技術(shù)篩選其陽性表達的細胞，進行細胞功能研究。CAFs 不具備內(nèi)皮細胞或上皮細胞的特征，可使用CD31/血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（platelet and endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1）、細胞角蛋白（cytokeratin，CK）及上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EPCAM）作為CAFs 的陰性標志物[5,8]?；贑AFs 的高度異質(zhì)性，選用多種分子標志物并結(jié)合形態(tài)學(xué)特點將有助于CAFs 的識別。

2 炎癥微環(huán)境介導(dǎo)CAFs 與腫瘤細胞間的交互對話

CAFs 與腫瘤細胞之間的作用是相輔相成的。在一定條件下，CAFs 誘導(dǎo)腫瘤的起源和腫瘤細胞增殖，而腫瘤細胞也可促進CAFs 的產(chǎn)生和激活。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，究竟哪種細胞起先導(dǎo)作用，目前尚無定論。

炎癥是腫瘤的重要標志之一，在促進CAFs 形成及調(diào)控CAFs 活性的過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞可分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、IL-8、巨噬細胞遷移抑制因子（microphage migration inhibitory factor，MIF）等細胞因子，參與形成腫瘤炎癥微環(huán)境[9]。研究[10]表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和IL-6可以調(diào)節(jié)成纖維細胞的侵襲活性。體外實驗[11]證實，胰腺癌細胞產(chǎn)生的IL-1β 通過激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶上調(diào)CAFs 細胞內(nèi)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路。乳腺癌細胞分泌的TNF-α 和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）的表達，進而選擇性降解Ⅳ型膠原纖維和層粘連蛋白，促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[5]。

活化狀態(tài)的CAFs 通過釋放大量生長因子和炎癥因子維持其活化表型，而炎癥環(huán)境又是腫瘤發(fā)生的一個啟動因素[12]。來源于CAFs 的IL-6 和TGF-β1 起到促進EMT 及腫瘤細胞增殖的作用[13]。IL-6、抑瘤素M（oncostatin M， OSM）、LIF 等IL-6 細胞因子家族通過刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）擴增腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）[14]。CSCs 通常保持在靜息狀態(tài)，參與化學(xué)治療和放射治療抵抗。由此可見，IL-6 既可由腫瘤細胞產(chǎn)生，上調(diào)CAFs 活性，也可由CAFs 分泌，調(diào)控腫瘤干性及腫瘤細胞增殖，兩者之間存在交互對話。除此之外，CAFs 分泌的外泌體能夠過表達TGF-β1，通過Smad 信號通路提高腫瘤的侵襲能力[15]。從黑色素瘤組織中分離出的CAFs 能夠分泌MMPs，裂解表達在腫瘤細胞表面的自然殺傷細胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）的配體主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A（major histocompatibility complex class Ⅰchain-related protein A，MICA）和MICB，降低黑色素瘤細胞對自然殺傷細胞（natural killer cells，NK 細胞）的敏感性[16]。

3 CAFs 對免疫細胞的調(diào)控作用

3.1 CAFs 對固有免疫細胞的調(diào)控作用

參與腫瘤免疫的固有免疫細胞主要有腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）、腫瘤相關(guān)中性 粒 細 胞（tumor-associated neutrophils，TANs）、NK 細胞、髓系來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），及樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）（圖1）。由于DCs 的抗原提呈作用與T 細胞功能的發(fā)揮密切相關(guān)，其研究進展將在適應(yīng)性免疫細胞中介紹。

CAFs 招募免疫細胞的過程主要通過CC 類趨化因子配 體（CC-chemokine ligand，CCL）、CXC 類 趨 化 因 子配體（CXC-chemokine ligand，CXCL）及集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）實現(xiàn)。TAMs 可分為M1型和M2 型，前者發(fā)揮抗腫瘤作用，后者則促進腫瘤進展。CAFs 釋放CXCL12/基質(zhì)細胞衍生因子（stromal cellderived factor 1，SDF1）、M-CSF/CSF-1、IL-6 和CCL2/單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），募集單核細胞至腫瘤微環(huán)境，并誘導(dǎo)單核細胞向M2 型巨噬細胞分化，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[17]。TANs 與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)。與TAMs 相似，TANs 也可分為抗腫瘤的N1 型和促腫瘤的N2 型。CAFs 是TGF-β 的重要來源，當TGF-β 被阻斷時，TANs 表現(xiàn)為N1 型，起到殺傷腫瘤細胞的作用；當TGF-β 水平較高時，TANs 表現(xiàn)為N2 型，抑制CD8+T 細胞的功能[18]。NK 細胞通過細胞毒性作用參與早期免疫應(yīng)答，并分泌細胞因子，促進抗原提呈細胞的成熟，強化適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在多種腫瘤中，CAFs 可通過分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和吲哚胺-2, 3-雙加氧酶（indoleamine-2, 3-dioxygenase，IDO）下調(diào)NK 細胞表面激活受體NKp30、NKp44、NKG2D、穿孔蛋白以及顆粒酶B（granzyme B，GraB）的表達，削弱NK 細胞對腫瘤的殺傷作用[17]。MDSCs 是一類來源于骨髓的異質(zhì)性細胞，是DCs、巨噬細胞和粒細胞的前體，發(fā)揮重要的免疫抑制功能。CAFs 分泌IL-6激活STAT3 通路，募集單核細胞并使其分化為MDSCs，抑制T 細胞功能，形成免疫抑制微環(huán)境[19]。Vinit 等[20]發(fā)現(xiàn)抑制集落刺激因子1 受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R）和CXC 類趨化因子受體2（CXCchemokine receptor 2，CXCR2）可以降低腫瘤組織中TAMs 和 多 形 核MDSCs（polymorphonuclear myeloidderived suppressor cells，PMN-MDSCs）的比例，阻礙腫瘤細胞的生長。

3.2 CAFs 對適應(yīng)性免疫細胞的調(diào)控作用

DCs 是參與抗原提呈的主要細胞，能夠激活T 細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。在CAFs 分泌的TGF-β 作用下，DCs 下調(diào)抗原提呈所需的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） Ⅱ類 分 子 及CD40、CD80、CD86 等共刺激分子[17]。從肺癌組織中分離的CAFs 可以表達色氨酸-2, 3- 雙加氧酶（tryptophan-2, 3-dioxygenase，TDO），促進犬尿氨酸中色氨酸的降解，從而抑制DCs 的分化和功能[21]（圖1）。

CD8+T 細胞通常指細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cells，CTLs），是殺傷腫瘤的關(guān)鍵細胞。CAFs 對CTLs 的影響主要包括2 個方面：①抑制CTLs 募集。②直接誘導(dǎo)其死亡。Kato 等[22]檢測了CAFs 與結(jié)腸癌細胞共培養(yǎng)條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoxP3+TILs （Tregs）含量增高而CD8+TILs（CTLs）含量降低，其原因在于CAFs 分泌了大量的IL-6。而CAFs 來源的CXCL12 能夠限制T 細胞遷移至腫瘤組織[23]。此外，CAFs 還可通過程序性細胞死亡配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PD-L2）和Fas 配 體（Fas ligand，F(xiàn)ASL）殺 死CD8+T 細 胞[24]，TGF-β 則通過抑制B 細胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）的表達促進CD8+T 細胞死亡[25]（圖1）。

調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）參與免疫耐受的形成。CAFs 通過IL-1β/CCL22/CC 類趨化因子受體4 （CC-chemokine receptor 4，CCR4）軸募集Tregs[26]（圖1）。 Costa 等[27]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中CAF-S1 亞型可以誘導(dǎo)Tregs分化和活性上調(diào)，但CAF-S4 亞型未表現(xiàn)出該能力。因此，不同亞型的CAFs 對Tregs 的調(diào)節(jié)作用可能不同。研究[28]發(fā)現(xiàn)，在小鼠胰腺癌模型中消除Tregs 既沒有改善腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，也沒有減緩腫瘤的進展。該研究發(fā)現(xiàn)Tregs 是TGF-β 的關(guān)鍵來源，而纖維細胞上廣泛表達TGF-β 的受體TGFR，Tregs 的缺失使得纖維細胞群發(fā)生重組，SMAhigh肌性成纖維細胞數(shù)量明顯下降，重組后的纖維細胞群分泌CCL3、CCL6、CCL8 并募集髓系細胞，促進免疫抑制微環(huán)境的形成，為腫瘤發(fā)生提供條件。這一研究結(jié)果使得傳統(tǒng)觀點受到挑戰(zhàn)，同時也表明腫瘤是一個高度復(fù)雜的復(fù)合體，目前人們對腫瘤微環(huán)境的認識仍很匱乏。

除了影響CTLs 參與的免疫應(yīng)答，CAFs 還可通過輔助性T 細胞（helper T cells，Th 細胞）抑制CD8+T 細胞功能。Th 細胞通常為CD4+T 細胞，主要包括Th1 和Th2；Th1 細胞參與細胞免疫，促進CTLs 的殺傷作用，而Th2 細胞為腫瘤生長營造適宜環(huán)境。CAFs 能夠分泌TNF-α、IL-1β、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）并誘導(dǎo)Th2 細胞分化[29]（圖1）。在乳腺癌模型中，針對FAP+CAFs 的 DNA 疫苗促使Th2 細胞向Th1 細胞轉(zhuǎn)化，提高IL-2 和 IL-7 的表達水平，進而抑制TAMs和Tregs 的功能，并激活CTLs[30]。Elyada 等[31]應(yīng)用單細胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)一種表達MHC Ⅱ類分子的抗原提呈CAFs（antigen-presenting CAFs），但其缺乏誘導(dǎo)T 細胞增殖的共刺激因子，因此該CAFs 表達的MHC-Ⅱ類分子可能作為誘餌受體介導(dǎo)CD4+T 細胞失活或轉(zhuǎn)化為Tregs。

4 以CAFs 為靶點的免疫治療

4.1 直接靶向CAFs

靶向CAFs 的實現(xiàn)依賴于其特異性抗原的表達，F(xiàn)AP因表達在CAFs 表面而被廣泛應(yīng)用。在小鼠原位注射乳腺癌細胞模型中，口服靶向FAP 的DNA 疫苗能夠顯著抑制血管新生、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[32]。其療效得益于抑制Ⅰ型膠原的產(chǎn)生并招募更多的CD8+T 細胞。一種共價偶聯(lián)DM1（微管蛋白抑制劑）的FAP 單克隆抗體（FAP5-DM1）被應(yīng)用于多種異種移植的小鼠模型中，實驗結(jié)果表明該抗體能夠有效抑制腫瘤的生長，且無明顯的毒性反應(yīng)[33]。然而在臨床試驗中，目前尚無靶向FAP 治療有效的案例。甲磺酸鹽（小分子FAP 抑制劑）和西羅珠單抗（FAP 靶向單克隆抗體）都不能證明對結(jié)直腸癌患者有效，也因此未通過Ⅱ期臨床試驗[8]。且有研究[34]表明，以FAP 為靶點消滅CAFs 的同時會損傷骨髓間充質(zhì)干細胞，從而帶來致命性的骨髓毒性。以上研究使得直接靶向CAFs 在臨床的應(yīng)用前景不容樂觀。

4.2 間接靶向CAFs

考慮到特異性標志物的缺乏，以及直接靶向CAFs 帶來的毒性反應(yīng)，研究者們開始著眼于抑制CAFs 產(chǎn)生的效應(yīng)分子。FAP+CAFs 是SDF1 的唯一來源。SDF1 作用于其受體CXCR4 可阻礙CD8+T 細胞浸潤，促進免疫抑制微環(huán)境的形成；應(yīng)用CXCR4 抑制劑AMD3100 作用于SDF1/CXCR4 軸可以逆轉(zhuǎn)FAP+CAFs 導(dǎo)致的免疫抑制[23]。SDF1/CXCR4 拮抗劑的安全性正在進一步驗證中，有可能成為改善T 細胞浸潤的替代療法[35]。第一代TGF-β 抑制劑具有心血管毒性等嚴重的不良反應(yīng)，新一代的TGF-β 激酶抑制劑以及TGF-β 中和抗體的臨床試驗正在進行中，并表現(xiàn)出良好的耐受性[34]。以TGF-β 和程序性細胞死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）/程序性細胞死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）為靶點的聯(lián)合治療具有改善T 細胞浸潤、緩解PD-1 抑制T 細胞功能的潛在作用，該治療策略目前正在多種實體瘤中進行驗證[36]。IL-6 單抗聯(lián)合阻斷PD-L1 在鼠黑色素瘤模型中發(fā)揮協(xié)同作用[37]。MMPs 是CAFs 進行ECM 重塑的重要成員。大量的臨床前試驗證明，抑制MMPs 具有抗腫瘤的潛能，但鑒于MMPs 家族的復(fù)雜性，超過50 種MMPs 抑制劑在Ⅲ期臨床試驗中均宣告失敗[38]。了解MMPs 在不同腫瘤中的作用及機制可能有利于實現(xiàn)MMPs 抑制劑在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。

5 總結(jié)與展望

CAFs 促進腫瘤發(fā)生及進展的觀點已被廣泛接受。盡管研究者們針對CAFs 展開了大量的研究，但到目前為止仍然存在著很多未知領(lǐng)域，尤其是CAFs 的高度異質(zhì)性為闡明CAFs 調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機制帶來不小的困難。單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用為該領(lǐng)域提供了更多可能。CAFs 與腫瘤細胞及免疫細胞的相互作用較為復(fù)雜，其調(diào)控腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)分子值得進一步探索。此外，以CAFs 為靶點的藥物試驗面臨著諸多挑戰(zhàn)，尋找其特異性的分子標志物或探究其不同亞型的生物學(xué)功能是未來需要解決的關(guān)鍵問題。

參·考·文·獻

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