朱敏，吳葉菊，高靜，來依寧，卡米拉，陸建萍，韓擎明,黃麗歡

（克拉瑪依市中心醫(yī)院，新疆 克拉瑪依）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為病變特征的疾病，氣流受限進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，目前臨床癥狀和肺功能是COPD 診斷與病情分級的主要依據(jù)，但易受年齡等因素影響，不能全面評估病情。在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中，小氣道重塑（Small Airway Remolding，SAR）形成是COPD 氣流阻塞的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，是COPD 病變持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。SAR 指的是氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，其重要的一個病理學(xué)特點(diǎn)就是細(xì)胞外基質(zhì)沉積，特別是成纖維細(xì)胞增生，膠原沉積。成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生和維持細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞成分。異常成纖維細(xì)胞激活可能是引起組織病理性重構(gòu)的主要原因。本文旨在探究miR-200s、SEC23A 在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的表達(dá)影響及與小氣道重塑（SAR）相關(guān)性分析，研究如下。

1 研究內(nèi)容與方案

1.1 研究內(nèi)容

觀察miRNA-200s，SEC23A 在COPD 患者樣本的小氣道，以及WS 在體內(nèi)外誘導(dǎo)的COPD 模型中的表達(dá)，分析該表達(dá)與SAR之間的相關(guān)性。

1.2 研究方案

a. 篩 選COPD 患 者 樣 本，運(yùn) 用 免 疫 組 織 學(xué)，RT-PCR 和Western blot 分別檢測miRNA-200s 和SEC23A 的表達(dá)。

b. 分別在大鼠以及培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中，用WS 誘導(dǎo)體內(nèi)外COPD 模型，分別以正?？諝馕氪笫蠛蜕睇}水處理細(xì)胞為正常對照組，免疫組織學(xué)， RT-PCR 和Western blot 分別檢測miRNA-200s 和SEC23A 的表達(dá)。

注：本實驗室已經(jīng)具備運(yùn)用WS 在體內(nèi)外建立COPD 模型技術(shù)和設(shè)備。

c. SAR 相關(guān)指標(biāo)的檢測，對于COPD 患者樣本和大鼠肺組織，主要檢測小氣道壁厚度和膠原沉積：取各組肺組織，HE 染色，選取直徑小于2mm 的小氣道作為觀察目標(biāo)。400 倍鏡下隨機(jī)取四個視野/組，分別測量小氣道基底膜長度（Pbm），基底膜界定面積（Abm）和小氣道外膜周長界定的面積（Ao）。運(yùn)用公式計算整個小氣道面積（WAt）：WAt=Ao-Abm。小氣道壁厚度為被Pbm 的平方校正的WAt 值。沉積的膠原量為被Pbm 校正的小氣道周圍膠原面積。對于體外實驗，主要用Sircol assay 檢測培養(yǎng)細(xì)胞分泌至培養(yǎng)上清中的Col I。

d. 運(yùn)用相關(guān)統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行以上各組miRNA-200s 或者SEC23A 與SAR 指標(biāo)之間的相關(guān)性分析。

2 實驗結(jié)果

(1) 使大鼠吸入WS，在體內(nèi)誘導(dǎo)COPD 模型( 分為20mg/L和40mg/L 刺激組)，以正?？諝馕氪笫鬄檎φ战M，HE 檢測顯示與正常對照細(xì)織相比，WS 刺激組小氣道上皮細(xì)胞排列紊亂，氣道管壁明顯增厚，并呈WS 濃度依賴性。免痠組織化學(xué)染色顯示，與正常對照組織相比，WS 刺激組SEC23A 表達(dá)明顯增加，而RT-PCR 結(jié)果顯示 miRNA200c 表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，均呈WS 濃度依性。免熒光結(jié)果顯示，與正常對照組相比，WS 刺激組氣道組織中，Vimentin 表達(dá)增強(qiáng)，而E-cat 則失去正常的膜表達(dá)方式sircol soluble collagen assay 檢別結(jié)果顯示，WS 刺激組Collagen Ⅰ分明顯增加，并呈WS 濃度依性。上述各實驗中，WS刺激組與正常對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。

(2)在培養(yǎng)的16HBE 中加入10mg/L WSC 體外誘導(dǎo)COPD 模型，以生理鹽水處理的細(xì)胞為正常對照組，相差顯微下，正常氣道上皮細(xì)胞為立體、稍微凸起及細(xì)胞間緊密連接，WSC 刺激組細(xì)胞間隙增寬，失去細(xì)胞間接觸，部分細(xì)胞發(fā)生長梭形，多角形改變。與正常對照組相比，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示W(wǎng)SC 刺激組SEC23A 表達(dá)明顯增加，上皮型標(biāo)記蛋白E-cat 表達(dá)降低而間質(zhì)型標(biāo)記蛋白Vimentin表達(dá)增強(qiáng)，提示出現(xiàn)EMT 現(xiàn)象；RT-PCR 結(jié)果顯示miRNA200c 表達(dá)下降，srolsoluble collagen assay 檢測顯示Collagen Ⅰ分沁明顯增加。WS 刺激組與正常對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，在肺部疾病中占最大比例的COPD 被列為世界第四號奪命殺手，僅次于腫瘤、心腦血管疾病和艾滋病的發(fā)病率。COPD 是一種多因素的疾病，其患病率本身易受地理環(huán)境、社會經(jīng)濟(jì)、生活方式等因素的影響。COPD 是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，是一種常見的慢性疾病。與氣道、肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，致殘率與病死率極高，嚴(yán)重危害患者生存狀態(tài)。目前臨床診斷COPD 主要通過常規(guī)肺功能檢查，但其方法具有一定局限性，同一肺功能水平患者可能有不同臨床表現(xiàn)、生存狀態(tài)，對同一種治療方法敏感性亦不同。

新疆地處我國西北部，氣候干燥，冬季長夏季短，綠化面積少，周圍繞沙漠，風(fēng)塵大降雨少，并且新疆少數(shù)民族特有的烹飪和飲食習(xí)慣，造成了由生物燃料（木材、木炭、動物糞便、莊稼桿和其他植物）導(dǎo)致的大量煙霧污染。新疆這種特殊的地理環(huán)境和人文環(huán)境導(dǎo)致的大氣污染，是引起該地區(qū)COPD 高發(fā)的不容忽視的客觀因素。明確COPD 發(fā)病機(jī)制，探索和尋求新的COPD 治療方法，干預(yù)和逆轉(zhuǎn)疾病過程，提高人民生活質(zhì)量的任務(wù)迫在眉睫。鑒于SAR 在COPD 發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，直接影響到患者的預(yù)后和生存質(zhì)量，阻斷SAR 病程已經(jīng)成為當(dāng)前國內(nèi)外COPD 的研究熱點(diǎn)。由于COPD病因機(jī)制較為復(fù)雜，單用某種化學(xué)藥物作用相當(dāng)有限，在2011 年底頒布的最新COPD 診斷，處理和預(yù)防的全球策略中，以糖皮質(zhì)激素抗炎以及支氣管舒張解痙劑為主要手段的治療，對COPD 氣道炎癥具有一定的改善作用，但不能阻止肺功能長期下降的趨勢，并且長期，大劑量使用糖皮質(zhì)激素將出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及毒副作用。因此，在病變根本中尋求多靶點(diǎn)防止COPD，特別是從細(xì)胞和分子機(jī)制上干預(yù)SAR 的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。