肖蓉 鄧舒

摘?要：從腐熟牛糞中篩選兼具降解纖維素功能和抗草莓重茬病害功能的細(xì)菌，為草莓夏季高溫悶棚時(shí)提供菌種資源。結(jié)果：篩選出1株有纖維素降解功能的細(xì)菌JN2，水解圈直徑達(dá)14 mm;JN2對(duì)草莓灰霉菌、鐮刀菌和擬盤多毛孢菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用;離體葉片實(shí)驗(yàn)中，JN2對(duì)草莓灰霉病的防效達(dá)97%，盆栽試驗(yàn)也驗(yàn)證了JN2對(duì)草莓灰霉病有較高的防效;經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA測(cè)序，JN2被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：纖維素降解;重茬病害;草莓;生物防治

文章編號(hào)：2096-8108（2020）06-0007-04??中圖分類號(hào)：S601??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Isolation and Application of Bacterium with

Resisting Strawberry Replant Diseases and Cellulose Degrading

XIAO Rong， DENG Shu

（Pomology Institute， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China）

Abstract：In order to provide bacterial resources for strawberry greenhouse by high temperature controlling， bacterium from cow dung with the function of both cellulose degrading and resisting replant diseases was isolated. The results showed that a strain named JN2 had cellulose degradation function with a hydrolysis ring diameter up to 14 mm. JN2 showed strong antagonistic effects against strawberry

Botrytis Cinerea， Fusarium sp. and Pestalotiopsis sp.. In vitro leaf experiments， JN2 was effective against strawberry Botrytis Cinerea to 97%. Pot experiments had also been shown to be effective. By morphological， physiological and biochemical characteristics and 16SrDNA sequencing， JN2 was identified as Bacillus Amyloliquefaciens.

Keywords：cellulose degrading; replant diseases; strawberry; biological control

在生產(chǎn)上，為了保證優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，設(shè)施栽培草莓每年都換新苗，重茬問(wèn)題在所難免，重茬病害嚴(yán)重

成為草莓設(shè)施栽培中的一大難題。近幾年，隨著高溫悶棚技術(shù)的普及，多數(shù)果農(nóng)均會(huì)在7-9月對(duì)草莓大棚進(jìn)行高溫悶棚殺菌，以減輕土壤中病原菌基數(shù)[1]。研究指出，悶棚時(shí)將秸稈、蘑菇菌渣、牛糞等有機(jī)物一起施入土壤，既可以提高地溫，又可以增加土壤肥力，殺菌、殺蟲與施肥同步進(jìn)行，一舉多得[2-5]。但是由于各地每年的氣溫條件都不一樣，如果在悶棚期間遇到連日陰天，則施加的秸稈、蘑菇菌渣等有機(jī)物不能充分腐熟，就會(huì)影響新栽的草莓苗生長(zhǎng)。因此，為了保證有機(jī)物的充分腐熟以及病原菌的消殺，人們?cè)诟邷貝炁飼r(shí)需分別添加具有纖維素降解功能和病害拮抗功能的生物菌劑[6]。本試驗(yàn)研究旨在篩選一種兼具纖維素降解功能和草莓病害拮抗功能的細(xì)菌，以使生產(chǎn)中進(jìn)行高溫悶棚時(shí)更便捷高效。

1?材料與方法

1.1?細(xì)菌的篩選

初篩：以能夠產(chǎn)生纖維素降解酶為初篩指標(biāo)。以腐熟牛糞為原材料，將10 g牛糞放入90 ml無(wú)菌水中，充分震蕩混勻，然后梯度稀釋到10-8濃度。取10-6、10-7、10-8濃度的稀釋液0.2 ml涂布在羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上，37 ℃黑暗條件倒置培養(yǎng)。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基配方為：羧甲基纖維素鈉15 g/L，酵母粉1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硝酸銨1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。待單菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種于新的羧甲基纖維素鈉固體平板，37 ℃，恒溫培養(yǎng)72 h，剛果紅染色，篩選出透明圈較大的菌落，編號(hào)，轉(zhuǎn)移到新的平板上，多次劃線培養(yǎng)純化后接于羧甲基纖維素鈉固體斜面上，4 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

復(fù)篩：采用平板對(duì)峙培養(yǎng)方法，以本實(shí)驗(yàn)室保存的常見草莓病原菌灰霉菌、鐮刀菌和擬盤多毛孢菌為靶標(biāo)菌進(jìn)行復(fù)篩。取病原菌菌絲接種于PDA固體培養(yǎng)基平板中央，按等邊三角形3個(gè)頂點(diǎn)的方向?qū)⒊鹾Y細(xì)菌接種于病害菌周圍，于28 ℃條件下黑暗倒置培養(yǎng)。以只接種病害菌，不接種細(xì)菌的平板作為對(duì)照。10 d以后觀察病害菌生長(zhǎng)狀況。

1.2?細(xì)菌鑒定

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]方法進(jìn)行生理生化鑒定。

分子鑒定：挑取細(xì)菌單菌落接于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取200 μl菌液，12 000 rpm離心5 min，棄上清，于沉淀中加入40 μl滅菌超純水，充分混勻后，置于100 ℃水浴5 min裂解，裂解液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物為通用引物27F和1492R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列為：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR體系為：10× PCR Buffer 5 μL， dNTPs 1.5μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，rTaq酶1 μL，加水補(bǔ)齊至50 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃ 3 min;94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送往北京華大生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)頁(yè)blast比對(duì)獲知菌株的分子鑒定結(jié)果。

1.3?菌株對(duì)草莓灰霉病的防治

1.3.1?草莓活體組織測(cè)試

采用葉片法測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵原液對(duì)草莓灰霉病的防效。將生長(zhǎng)健康、大小一致的草莓葉片從葉柄處剪斷，用自來(lái)水將葉片表面沖洗干凈，再用70%乙醇進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗干凈后，在JN2發(fā)酵液中浸漬3 min，晾干，葉面朝上放于鋪有無(wú)菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，葉柄用浸濕的滅菌棉球包裹。采取牙簽劃傷接種的方式將灰霉菌菌絲接種到葉片上。以無(wú)菌水代替發(fā)酵液做對(duì)照。每組葉片共有30片。實(shí)驗(yàn)15 d以后進(jìn)行病害調(diào)查。根據(jù)每片葉子的變褐情況以目測(cè)法對(duì)病情進(jìn)行記載。

草莓葉部病害病級(jí)按5級(jí)劃分：

0級(jí)：無(wú)病;

1級(jí)：發(fā)病面積占葉表面積1/4以下;

2級(jí)：發(fā)病面積占葉表面積1/4-1/2;

3級(jí)：發(fā)病面積占葉表面積1/2-1/3;

4級(jí)：發(fā)病面積占葉表面積3/4以上。

病情指數(shù)（%）=∑每一級(jí)的級(jí)值×該級(jí)的葉片數(shù)總?cè)~片數(shù)×最大級(jí)值×100

1.3.2?草莓盆栽測(cè)試

采用盆栽灌根法進(jìn)行，取處于苗期的生長(zhǎng)健壯、無(wú)病草莓苗為試材。將細(xì)菌接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，

37 ℃培養(yǎng)3 d后作為供試發(fā)酵原液。將草莓灰霉病菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)5 d后備用。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)置3次重復(fù)，每盆種植一株健康、且長(zhǎng)勢(shì)一致的草莓苗。實(shí)驗(yàn)組中，在草莓苗根部開溝，將培養(yǎng)好的細(xì)菌發(fā)酵液倒入溝內(nèi)，待菌液被土壤全部吸收24 h后，倒入灰霉菌菌懸液，再覆蓋溝槽。對(duì)照組中，以無(wú)菌水替代細(xì)菌發(fā)酵液，其余步驟相同。用保鮮膜覆蓋土壤以利于保濕。其余澆水等按常規(guī)管理方式管理。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株篩選

從腐熟牛糞中分離出18株有纖維素降解功能的細(xì)菌，經(jīng)復(fù)篩獲得1株透明圈較大的菌株，培養(yǎng)2 d時(shí)菌落直徑（d）為2 mm，水解圈直徑（D）為14 mm，D/d值達(dá)7，編號(hào)為JN2，如圖1所示。

2.2?菌株對(duì)病原菌的平板拮抗效果

從圖2中可以明顯看出，與對(duì)照相比，當(dāng)在培養(yǎng)基上同時(shí)接種JN2時(shí)，草莓灰霉菌、鐮刀菌和擬盤多毛孢菌生長(zhǎng)明顯受到抑制，說(shuō)明JN2對(duì)這3種常見草莓病原菌有強(qiáng)烈的拮抗作用。

2.3?菌株鑒定

2.3.1?菌株形態(tài)及生理特征

JN2在羧甲基纖維素鈉固體平板上的培養(yǎng)特征為：菌落邊緣不整齊，呈放射狀，直徑2～3 cm，淺黃色，不透明，表面濕潤(rùn)（圖3），采用簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色觀察JN2細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成串出現(xiàn)，有芽孢，芽孢囊不膨大，芽孢橢圓形，中生（圖4）。JN2的部分生理生化特征見表1。

2.3.2?菌株的分子鑒定

菌株JN2的序列長(zhǎng)度為1406bp，使用NCBI的BLASTN工具對(duì)JN2菌株的16SrDNA 序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，JN2與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16SrDNA相似度達(dá)100%。

根據(jù)對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征、生理生化和分子鑒定的研究結(jié)果，菌株JN2鑒定為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌JN2在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記號(hào)為CGMCC No：10677。

2.4?JN2對(duì)草莓灰霉病的防治

選擇灰霉菌作為靶標(biāo)菌進(jìn)一步驗(yàn)證JN2的實(shí)際應(yīng)用效果。離體草莓葉片接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，可見：只接種灰霉菌的對(duì)照組，幾乎全部染病，葉片出現(xiàn)茶褐色病斑，病斑逐漸擴(kuò)大，15 d后，有的整片葉子均變?yōu)椴韬稚?，且表面覆蓋一層灰褐色菌絲，病情指數(shù)達(dá)87.5%。實(shí)驗(yàn)組葉片先經(jīng)JN2處理后再接種HM，15 d后，僅有少量葉片出現(xiàn)茶褐色病斑，病情指數(shù)僅為2.5%。說(shuō)明JN2對(duì)草莓灰霉病具有較高的防效。

為了檢驗(yàn)JN2在實(shí)際土壤環(huán)境下對(duì)HM病的防效，我們?cè)O(shè)置了盆栽試驗(yàn)。將處理后的草莓苗在25 ℃條件下培養(yǎng)。30 d以后，發(fā)現(xiàn)不加JN2發(fā)酵液的對(duì)照組葉片有褐色斑點(diǎn)，葉緣發(fā)黃褐化，甚至整片葉子干枯。而用JN2發(fā)酵液處理過(guò)的試驗(yàn)組葉片不見斑點(diǎn)和黃化，表現(xiàn)正常（圖6）。說(shuō)明在盆栽條件下，JN2發(fā)酵液也表現(xiàn)出對(duì)灰霉病的防治作用。

3?討論與結(jié)論

鐮刀菌屬真菌（Fusarium sp.）在世界范圍內(nèi)分布廣泛，它可危害多種植物，破壞植物的維管束系統(tǒng)，引起植物萎蔫死亡和器官腐爛，是生產(chǎn)上防治最艱難的土傳病害之一。在草莓上可引起枯萎病[8]，使草莓根部維管束變褐，葉片卷縮、萎蔫直至全株死亡。擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）是著名的植物病原體品種，在草莓上能引起葉斑病[9]，主要危害葉片，起初產(chǎn)生紅褐色病斑，后中央變?yōu)闇\褐色，產(chǎn)生輪紋，邊緣出現(xiàn)明顯的暗褐色壞死帶，嚴(yán)重時(shí)葉片枯死?；颐共≡诓葺L(zhǎng)期、花期、果期均有可能發(fā)生，病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis Cinerea），其菌絲、菌核及分生孢子可以在土壤或病殘?bào)w上越冬或越夏，是草莓最嚴(yán)重的土傳病害之一[10]。本研究中分離出的JN2菌株對(duì)上述3種病原菌均表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用，因此，可以在下一步考慮將JN2作為草莓專用生防菌劑。因其還兼具纖維素降解功能，故在高溫悶棚時(shí)，只施加JN2一種菌劑，就可以同時(shí)滿足腐熟有機(jī)物及消殺病原菌功能。但還需在下一步試驗(yàn)中優(yōu)化JN2的產(chǎn)酶條件，以提高纖維素降解功能。

總之，本試驗(yàn)從腐熟牛糞中分離出1株有纖維素降解功能的細(xì)菌JN2，水解圈直徑達(dá)14 mm;在平板上JN2對(duì)草莓灰霉菌、鐮刀菌和擬盤多毛孢菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用;離體葉片實(shí)驗(yàn)中，草莓灰霉病病情指數(shù)達(dá)87.5%，

試驗(yàn)組葉片病情指數(shù)僅為2.5%，JN2對(duì)草莓灰霉病的防效達(dá)97%，盆栽試驗(yàn)也驗(yàn)證了JN2對(duì)草莓灰霉病有較高的防效;經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA測(cè)序，JN2被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

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