潘波 陳喜生

(1.國藥控股股份有限公司，上海 200030；2.國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，福建 廈門 361026)

0 引言

葉酸是指必需的水溶性B族維生素類藥物，由三個部分組成：蝶啶環(huán)，對氨基苯甲酸酯和谷氨酸。多官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)賦予了葉酸復(fù)雜化學(xué)性質(zhì)，使得葉酸較易含有結(jié)晶水和吸附水[1]，穩(wěn)定性受到pH，溫度，光線，氧化劑和還原劑的影響。在受熱的情況下，葉酸通常通過在C9-N10處裂解而降解，生成6-甲?；屎桶被郊姿醄3]，因此，干燥失重測水分的方法不適用于葉酸。目前《中華人民共和國藥典》以下簡稱《中國藥典》)2015年版采用卡爾費(fèi)休法進(jìn)行水分測定[3]，葉酸的水分在測定時釋放緩慢，使得水分檢測時間較長[4]，增大了環(huán)境因素對檢測結(jié)果的影響。通過將葉酸樣品中的水分轉(zhuǎn)移到易釋放水分的溶劑中，設(shè)置轉(zhuǎn)移所需要的萃取時間，避免滴定過程提前結(jié)束，使葉酸水分釋放更充分。因此，本文采用三氯甲烷-無水甲醇萃取水分的溶劑，使用萬通915卡式費(fèi)休水分測定儀測定葉酸水分，通過研究萃取時間與水分檢測結(jié)果的關(guān)系，確定最佳萃取時間，以提高卡爾費(fèi)休法測定葉酸水分的準(zhǔn)確性。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀器與試劑

卡氏水分儀(915，萬通)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；卡爾費(fèi)休試劑(3.6mg/mL)，甲醇(分析級)，三氯甲烷(分析純)均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 樣品來源

葉酸對照品來自中國食品藥品檢定研究所；葉酸樣品來自河北冀衡(集團(tuán))藥業(yè)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 反應(yīng)時間對葉酸水分檢測的影響

按照藥典準(zhǔn)確稱取純化水10mg，用水分測定儀進(jìn)行標(biāo)定。另作空白試驗(yàn)，計算[3]。按照藥典準(zhǔn)確稱取供試品0.1g，溶劑為無水甲醇，用水分測定儀直接測定，獲得水分含量[3]。

2.2 設(shè)備相關(guān)參數(shù)

萬通915卡氏水分儀方法設(shè)置參數(shù)為：“滴定速度”設(shè)置為最優(yōu)；“停止判據(jù)”設(shè)置為“漂移”；“停止漂移”為20μL/min；“漂移校正”設(shè)置為自動；進(jìn)行水分測定的“萃取時間”分別設(shè)置為0～400s。

3 結(jié)果與分析

3.1 供試品水分測定結(jié)果與分析

在不同萃取時間下，滴定過程中消耗的卡爾費(fèi)休試劑量與滴定時間的關(guān)系如圖1所示，萃取時間的延長，維持高速滴定反應(yīng)的時間延長，水分釋放更加充分。隨后反復(fù)出現(xiàn)滴定啟動與中止交替現(xiàn)象，每次滴定的體積減少，中斷的時間增加。隨著滴定反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系的水分越來越少，水分釋放速度越來越慢，當(dāng)?shù)味ǚ磻?yīng)消耗水的速度大于體系所能夠提供水，閾值范圍內(nèi)不能滿足啟動滴定反應(yīng)的要求則檢測過程結(jié)束。

圖1 不同萃取時間卡爾費(fèi)休試劑的消耗情況

萃取時間設(shè)為400s，在滴定反應(yīng)的0～21s內(nèi)，萃取劑中的水分高速釋放，反應(yīng)體系水分充足，滴定速度恒定，出現(xiàn)卡爾費(fèi)休試劑高速消耗的現(xiàn)象。在滴定反應(yīng)的21～400s內(nèi)，滴定過程頻繁出現(xiàn)中止又繼續(xù)進(jìn)行滴定的現(xiàn)象，啟動滴定系統(tǒng)進(jìn)行滴定反應(yīng)的時間越來越長，說明從葉酸樣品向滴定體系釋滿足最小滴定體積的卡爾費(fèi)休試劑完成反應(yīng)所需要水的時間越長，再次啟動滴定消耗的卡爾費(fèi)休試劑的體積越少，說明從葉酸樣品向滴定體系釋補(bǔ)充水的量越少。

證明葉酸樣品在水分釋放過程中，葉酸樣品本身的水分含量越來越低，釋放水分的速度越來越慢。由圖2a水分含量與反應(yīng)時間變化關(guān)系可以看到，在滴定過程的0～200s，隨著反應(yīng)時間的延長，測出的水分含量越來越高，增長的幅度越來越小，在滴定過程的200～400s，隨著反應(yīng)時間的延長，測出的水分含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，如圖2b相關(guān)性系數(shù)R=0.9994，相關(guān)系良好，說明水分增速恒定。但與上述葉酸樣品在水分釋放過程中速度越來越慢的現(xiàn)象矛盾，證明葉酸樣品在250s后水分釋放不是導(dǎo)致檢測水分上升的主要原因，葉酸樣品釋放水分遠(yuǎn)小于其他方面的水分來源，滴定體系中的水分來源于滴定體系周圍相對恒定的環(huán)境。

水分含量與萃取時間的變化關(guān)系如圖2c所示，萃取時間在0～400s內(nèi)，隨著時間延長，樣品中檢測出來的含水量越高，延長萃取時間使得葉酸中的水分釋放更加充分，含水量的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。萃取時間超過200～400s后，水分含量與萃取時間呈正比關(guān)系，如圖2d所示，并且相關(guān)系數(shù)R=0.9993，線性關(guān)系良好，水分含量的增量恒定，與樣品水分釋放逐漸減慢不相符，說明啟動設(shè)備進(jìn)行滴定反應(yīng)的這部分水來源不是由樣品中的水分釋放導(dǎo)致，可能是由于周圍環(huán)境中的水分進(jìn)入以恒定的速度進(jìn)入萃取體系導(dǎo)致，即葉酸樣品在萃取階段的第200s至400s釋放的水分趨近于0，延長萃取時間不會使得樣品中的水分萃取率提高，因此可以將200s作為最佳萃取時間。

延長萃取時間有利于葉酸樣品充分釋放水分，但增大了環(huán)境因素提高葉酸檢測結(jié)果的風(fēng)險，從避免延長萃取時間環(huán)境中的水分檢測影響，使樣品中的水分充分釋放的角度考慮，顯然萃取200s是萃取的最佳時間。

圖2 滴定過程的水分變化情況

3.2 葉酸對照品的水分測定的結(jié)果與分析

在對照品的檢測過程中，檢測到葉酸中含有7.78%的水，另外，李娜等[2]關(guān)于葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的研究報道顯示葉酸標(biāo)準(zhǔn)品含有7%～9%的水分，均印證葉酸易吸收水分與攜帶結(jié)晶水的特性，通常以含水的混合物形式存在。在《中國藥典》2015版中對于葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6[4]，描述了葉酸的活性部分，不能體現(xiàn)葉酸供試品、對照品與標(biāo)準(zhǔn)品通常以含水的混合物的形式存在，而對葉酸活性部分的物質(zhì)含量檢測具有重要影響。建議將葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6,xH2O，能夠直觀體現(xiàn)葉酸主要以含水的混合物形式存在。

4 結(jié)語

水分測定的結(jié)果將會影響原料的含量測定以及對照品賦值結(jié)果的準(zhǔn)確，本文采用萬通915卡爾費(fèi)休水分測定儀測不同萃取時間下葉酸水分的含量，確定在滴定前將葉酸樣品的水分萃取時間設(shè)為200s，能夠更加精確測得葉酸樣品中的水分含量，為葉酸水分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考方法。

在葉酸的樣品與對照品的研究過程中，以及已報道的關(guān)于葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的研究過程中，均檢測到7%～9%的水分。建議將葉酸的分子式書寫成C19H19N7O6,xH2O，有助于研究人員、檢測人員、公眾等對葉酸的認(rèn)識更加直觀。