崔雅琦，白玉冰，許怡晨，譚心辰，李夢(mèng)瑩，賈 浩

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海市腫瘤微環(huán)境與炎癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025

近年來(lái)，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患病率逐漸攀升。一項(xiàng)最新研究[1]顯示，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥的總患病率為13%，總?cè)藬?shù)已超過(guò)1.78 億。老年人是骨質(zhì)疏松癥的重點(diǎn)人群，自1982 年起，我國(guó)65 歲以上老年人占人口比重不斷升高，2019 年我國(guó)65 歲以上老年人占人口比重已達(dá)到12.6%[2]。預(yù)計(jì)到2050 年，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥或骨密度低的患者將達(dá)到2.12 億[1]。骨質(zhì)疏松癥使得骨質(zhì)脆性增加、易于骨折，導(dǎo)致患者的生活水平急劇下降。利用脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松癥是醫(yī)學(xué)研究的新方向[1]。ADMSCs 可以通過(guò)旁分泌功能，分泌一些生物活性分子，為組織修復(fù)建立良好的微環(huán)境，促進(jìn)新生血管的形成和傷口愈合，并且減少組織的炎癥反應(yīng)。ADMSCs 也可分泌促進(jìn)血管生成和抗凋亡潛能的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin growth factor，IGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）[3]和骨形態(tài)發(fā)生蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）家 族BMP-2、BMP-7 等[4]。ADMSCs 來(lái)源豐富，通過(guò)脂肪抽吸術(shù)易于獲得，無(wú)免疫排斥。平均每300 mL 脂肪組織可獲得108個(gè) 細(xì)胞，每克動(dòng)物脂肪可獲得5 000 個(gè)成纖維集落形成單位（colony forming unit-fibroblast，CFU-F）[5]。同時(shí)，與其他來(lái)源的MSCs 相比，脂肪組織來(lái)源更為豐富，容易獲得。因此，ADMSCs 逐漸成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在組織的修復(fù)與重建。本文對(duì)ADMSCs 及外囊泡應(yīng)用于組織工程的狀況及未來(lái)展望進(jìn)行綜述。

1 ADMSCs 向成骨分化誘導(dǎo)的主要方式

1.1 分泌細(xì)胞因子

ADMSCs 可以自分泌或旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)其向成骨分化。ADMSCs 分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）和 胎 球 蛋 白A（fetuin-A），這兩者可以提高細(xì)胞內(nèi)RUNX2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表達(dá)，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[6]。另外，ADMSCs 也可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子BMP2 和TGF-β，激活TGF-β/BMPs 信號(hào)通路，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[7]。研究[7]還發(fā)現(xiàn)ADMSCs 中存在高表達(dá)Toll 樣受體1 ～5（Toll-like receptors 1-5，TLRs1-5），應(yīng)用TLRs 的激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)ADMSCs 分泌高濃度的白細(xì)胞介素-6（inteleukin-6，IL-6）。IL-6 單獨(dú)存在時(shí)對(duì)成骨分化沒(méi)有作用，但與可溶性白細(xì)胞介素6 受體（soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R）結(jié)合形成復(fù)合體后，兩者可共同發(fā)揮促進(jìn)成骨分化的作用。另外，有研究[8]顯示，組織微環(huán)境中分泌的其他細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），在經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因 子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF） 與核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的預(yù)處理之后，也可以顯著提高ADMSCs 向成骨分化。

1.2 分泌外囊泡

細(xì)胞外囊泡是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，由細(xì)胞分泌產(chǎn)生，包括外泌體、微囊泡和凋亡小體等。目前，關(guān)于細(xì)胞外囊泡促進(jìn)成骨分化的研究主要集中在外泌體的作用上[9]。

外泌體直徑為30 ～150 nm，由內(nèi)涵體產(chǎn)生，通過(guò)多泡體與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[10-11]，是細(xì)胞旁分泌的重要組成部分。人源ADMSCs 的外泌體形態(tài)呈杯狀，具有CD63 和CD9 等特異性標(biāo)記[12]。研究[12-13]顯示，ADMSCs 的外泌體可以促進(jìn)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs） 向成骨細(xì)胞分化。通過(guò)釋放的外泌體激活了BM-MSCs 中的RUNX2、ALP（alkaline phosphatase）和COL1A1（collagen type 1 α 1）等促成骨相關(guān)基因的表達(dá)，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。進(jìn)一步研究[14-15]還發(fā)現(xiàn)，ADMSCs 的外泌體可以作用于成骨分化后期的BM-MSCs，具體表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性大幅升高，有新生鈣質(zhì)生成，RUNX2、ALP和COL1A1 等促成骨相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。目前還有研究[14]發(fā)現(xiàn)，ADMSCs 的外泌體具有阻止MSCs 細(xì)胞凋亡、促進(jìn)MSCs 的增殖、促進(jìn)血管生成和促進(jìn)骨形成等作用。

2 ADMSCs 向成骨分化的信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 TGF-β/BMPs 信號(hào)通路

TGF-β/BMPs 信號(hào)通路參與絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物骨形成。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)鼠和人的ADMSCs 都可以被骨形態(tài)發(fā)生蛋白，如BMP-2 和BMP-7，誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化。BMPs 通過(guò)激活細(xì)胞表面受體復(fù)合物BMPR- Ⅰ（bone morphogenetic proteins receptor Ⅰ，BMPR- Ⅰ）、BMPR- Ⅱ 將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)后，受體活化型Smad（receptorregulated Smad，R-Smad）與共同通路型Smad（common Smad，Co-Smad）形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA啟動(dòng)子區(qū)域相互作用以激活成骨的重要轉(zhuǎn)錄因子如RUNX2[18]。BMPs 由多種細(xì)胞產(chǎn)生，并累積在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中。在組織修復(fù)和重塑過(guò)程中，BMPs 從ECM 中釋放出來(lái)，并與附近的細(xì)胞相互作用。研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，這兩類復(fù)合體BMP2/BMP7 和BMP2/BMP9 均可以誘導(dǎo)ADMSCs 向成骨分化。Xie 等[18]在大鼠中研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-146a（microRNA-146a，miR-146a）是一個(gè)ADMSCs 向成骨分化的負(fù)調(diào)控因子，抑制miR-146a的表達(dá)可以顯著提高成骨分化的能力。miR-146a 與Smad4的3'非翻譯區(qū)（3' untranslated region，3'UTR）結(jié)合，抑制了Smad4 的表達(dá)，降低了BMP2 誘導(dǎo)的ADMSCs 向成骨分化。這也提示我們miR-146a 可以作為一個(gè)ADMSCs 向成骨分化的靶標(biāo)。Lee 等[21]利用小鼠顱腦損傷模型的研究發(fā)現(xiàn)，BMP9 處理的ADMSCs 向成骨分化的能力遠(yuǎn)高于對(duì)照組，處理12 周的小鼠顱骨愈合度達(dá)到27.39%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的9.89%（P<0.05）。

2.2 Wnt 信號(hào)通路

Wnt（wingless/integrated，Wnt）信號(hào)通路可以促進(jìn)ADMSCs 向成骨細(xì)胞分化。Wnt 是FZD（frizzled protein family）受體的大家族配體。Wnt 信號(hào)通路存在3 種不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)：Wnt/β-catenin 途徑（經(jīng)典）、Wnt/Ca2+途徑（非經(jīng)典）和Wnt/planar polarity 途徑。研究[22]表明，經(jīng)典的Wnt/β-catenin 途徑和非經(jīng)典的Wnt/Ca2+都參與ADMSCs 向成骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路。經(jīng)典途徑是Wnt與FZD 或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein5/6，LRP5/6） 結(jié) 合 后，使β-catenin 處于未磷酸化的狀態(tài)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨分化。非經(jīng)典途徑是Wnt5 與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）結(jié)合后，激活磷脂酶C（phospholipases C，PLC）的表達(dá)，促進(jìn)Ca2+的釋放。釋放的Ca2+激活細(xì)胞內(nèi)的RUNX2、ALP和COL1A1 等促成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)ADMSCs 向成骨細(xì)胞分化。研究[23]發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)抑制miR-126a-3p 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)ADMSCs 向成骨方向分化。miR-126a-3p 是一個(gè)ADMSCs 成骨分化抑制因子，通過(guò)與LRP6 的3'UTR 結(jié)合，降低LRP6 的表達(dá)，阻斷Wnt 通路的激活，抑制ADMSCs 向成骨方向分化。

2.3 Notch 信號(hào)通路

Notch 信號(hào)通路在ADMSCs 的分化及器官形成的過(guò)程中發(fā)揮作用。在胚胎發(fā)育時(shí)，Notch 信號(hào)通路可以參與小鼠的軟骨及骨骼的形成。Liu 等[24]利用小鼠骨關(guān)節(jié)炎的模型研究發(fā)現(xiàn)，注射了BMP9 刺激的ADMSCs 可以促進(jìn)軟骨的再生，達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。主要機(jī)制是BMP9通過(guò)上調(diào)Notch1 和Jagged1 的表達(dá)，激活Notch 信號(hào)通路，促進(jìn)ADMSCs 向軟骨分化。Notch 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，但是方式相對(duì)復(fù)雜。Engin 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Notch 配體與受體互相作用后，激活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL（CBF-1、suppressor of hairless、Lag 的合稱）結(jié)合，激活HES-1（hairy and enhancer of split-1），HES-1 可以進(jìn)一步上調(diào)RUNX2 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨分化。Ji 等[26]研究還發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)在成骨的早期與晚期會(huì)有不同效果。因?yàn)?Notch 信號(hào)通路在成骨分化中的作用還不完全清楚，所以Notch 信號(hào)通路參與ADMSCs向成骨分化還有待進(jìn)一步研究。

2.4 Hedgehog 信號(hào)通路

Yalom 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L 的羥基膽固醇（一種膽固醇的氧化衍生物）可以顯著提高人的ADMSCs 向成骨分化。具體表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性大幅升高，有新生鈣質(zhì)生成，RUNX2、ALP 和COL1A1 等促成骨相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。加入環(huán)巴胺（Hedgehog 途徑抑制劑）可以逆轉(zhuǎn)這個(gè)現(xiàn)象，表明Hedgehog 信號(hào)通路促進(jìn)ADMSCs向成骨分化。Shigunov 等[28]利用嗎啡胺（Hedgehog 途徑激活劑）處理ADMSCs 后，發(fā)現(xiàn)Hedgehog 通路的相關(guān)蛋白——SHh 蛋白（Sonic hedgehog）、IHh 蛋白（Indian Hedgehog）和DHh 蛋白（Desert Hedghog）等作為細(xì)胞外信號(hào)與PTCH1（Patched-1）、PTCH2（Patched-2）以及Smo（Smoothened）相應(yīng)受體結(jié)合，激活SUFU（suppressor of Fused）、葡萄糖合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）、GSK3β 等胞內(nèi)小分子信使，促進(jìn)下游Gli1、Gli2、Gli3 的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)RUNX2、ALP 和COL1A1 等促成骨相關(guān)基因的表達(dá)；而利用環(huán)巴胺處理細(xì)胞后，結(jié)果正好相反。以上研究均證明了Hedgehog 信號(hào)通路參與調(diào)控ADMSCs 向成骨細(xì)胞分化。

2.5 FGF 信號(hào)通路

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）成員可以參與ADMSCs 向不同方向分化的調(diào)控[29]。FGF信號(hào)通路受多條信號(hào)通路調(diào)控，比如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase，MAPK）、應(yīng)激激活蛋白激酶/C-Jun 氨基末端蛋白激酶（stress-activated protein kinase/Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）系統(tǒng)和磷脂酰肌 醇3- 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 等，這些通路均與成骨細(xì)胞分化相關(guān)[30]。研究[31]發(fā)現(xiàn)，重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（recombinant human plateletderived growth factor-BB，rhPDGF-BB）可通過(guò)磷酸化ERK 激活MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)ADMSCs 向成骨分化。進(jìn)一步研究[32]發(fā)現(xiàn)，分別利用3 種可以誘導(dǎo)成骨分化的試劑FGFb、BMP2 和NELL1 依次處理ADMSCs 后，10 ng/mL 的FGFb 成骨效果最好，而B(niǎo)MP2 促進(jìn)成骨分化的效果略差于FGFb。該結(jié)果提示FGFb 可以作為ADMSCs成骨分化的首選激活劑。

3 ADMSCs 及外囊泡的臨床應(yīng)用前景

ADMSCs 可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子、細(xì)胞外囊泡的方式 激 活TGF-β/BMPs、Wnt、Notch、Hedgehog 和FGF 信號(hào)通路，促進(jìn)MSCs 向成骨細(xì)胞分化，因此ADMSCs 及外囊泡可能通過(guò)增加骨細(xì)胞數(shù)量治療骨質(zhì)疏松癥。本文從成本、安全性和應(yīng)用前景3 個(gè)角度，比較ADMSCs、ADMSCs 外囊泡和BM-MSCs 的異同點(diǎn)，探討ADMSCs及其外囊泡治療骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢(shì)和前景。

3.1 ADMSCs 及其外囊泡的提取成本低

ADMSCs 及其外囊泡可以取材于吸脂手術(shù)獲取的脂肪組織，創(chuàng)傷小，獲取方便。BM-MSCs 的分離提純則以骨髓作為原料，需要進(jìn)行侵入性手術(shù)，難度大，可行性低[14]。研究[33]發(fā)現(xiàn)，脂肪提取物中MSCs 的數(shù)量約占提取體積的2%，而骨髓中MSCs 的數(shù)量?jī)H占0.001%～1.004%。同樣體積的脂肪提取物與骨髓相比較，ADMSCs 提取率約是BM-MSCs 的8 倍。比較連續(xù)培養(yǎng)5 代的ADMSCs與BM-MSCs 的累計(jì)細(xì)胞群落增殖（cumulative population doublings，CPD），結(jié)果[34]顯示每一代ADMSCs 的CPD 均高于BM-MSCs，說(shuō)明ADMSCs 比BM-MSCs 具有更強(qiáng)的增殖能力。因此，ADMSCs 的獲得率遠(yuǎn)高于BM-MSCs，且增殖能力更強(qiáng)，用于臨床治療的可行性高。

3.2 ADMSCs 及其外囊泡的安全性高

MSCs 可以通過(guò)分泌炎癥細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6）和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子（如PGR2、TGF-β 和IDO）起到免疫調(diào)節(jié)的作用[34]。利用ADMSCs或者BM-MSCs 治療骨質(zhì)疏松癥，免疫排異反應(yīng)的發(fā)生概率可能會(huì)顯著降低。有臨床研究向患者注射自體的含有豐富ADMSCs 的脂肪來(lái)源的基質(zhì)血管成分（adiposederived stromal vascular fraction，ADSVF）[35]或同種異體ADMSCs[36]，患者的心電圖、生命體征和體格檢查沒(méi)有變化，不良反應(yīng)（包括瘺管、輕度至中度的疼痛和注射部位腫脹）也是短暫和可恢復(fù)的，證明ADMSCs 及其外囊泡的臨床應(yīng)用具有可行性和安全性。有研究[37-38]發(fā)現(xiàn)， BM-MSCs 的系統(tǒng)性輸入可能會(huì)誘發(fā)呼吸衰竭、心力衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血等不良反應(yīng)，說(shuō)明直接注射BM-MSCs治療骨質(zhì)疏松癥具有一定的危險(xiǎn)性。但是，無(wú)論是活細(xì)胞的ADMSCs 還是BM-MSCs 注射入人體后，其分化、增殖和凋亡等情況都不可控[39]。與之相比，采取注射MSCs分泌的外囊泡（如ADMSCs 外囊泡）等非細(xì)胞療法治療骨質(zhì)疏松癥可能是最安全可控的方法。

3.3 ADMSCs 外囊泡的應(yīng)用前景好

目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)分別移植含有ADMSCs[40-41]、ADMSCs 外囊泡[42]和BM-MSCs[43]的人工支架均可以促進(jìn)成骨再生。但是，MSCs 在體內(nèi)擴(kuò)增時(shí)可能發(fā)生表型的變化[42]，影響療效甚至造成不良反應(yīng)。相比之下，ADMSCs 的外囊泡無(wú)細(xì)胞分化的風(fēng)險(xiǎn)，更安全可控。另外，ADMSCs 的外囊泡可以直接從人的脂肪組織中提取，避免培養(yǎng)細(xì)胞耗費(fèi)時(shí)間。但是ADMSCs 的外囊泡促進(jìn)成骨分化的具體原因還不清楚，這也是今后研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)有研究[44]發(fā)現(xiàn)，人體不同部位的ADMSCs 增殖及其成骨分化能力具有差異。膝蓋和臂部的ADMSCs 增殖能力最強(qiáng)，但是成骨分化能力較弱，需要誘導(dǎo)成骨因子刺激才能向成骨方向分化。臀部和股區(qū)的ADMSCs 增殖速度較膝蓋和臂部弱，但顯示出很強(qiáng)的堿性磷酸酶活性和基質(zhì)礦化能力，向成骨分化能力最強(qiáng)[44]。但是這種差異的原因還不清楚。未來(lái)可以通過(guò)優(yōu)化脂肪提取部位，降低ADMSCs 及其外囊泡的應(yīng)用成本。

綜上所述，利用ADMSCs 外囊泡相較于ADMSCs 與BM-MSCs 具有更好的安全性，經(jīng)濟(jì)性和可行性，促進(jìn)成骨再生的應(yīng)用前景最好。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

本文介紹了ADMSCs 向成骨分化誘導(dǎo)的主要方式和ADMSCs 及外囊泡促進(jìn)成骨分化的相關(guān)調(diào)控信號(hào)通路。通過(guò)比較ADMSCs、ADMSCs 外囊泡與BM-MSCs 的提取成本、安全性和應(yīng)用前景，闡述了ADMSCs 及外囊泡具有轉(zhuǎn)化應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢(shì)。隨著我們對(duì)外囊泡認(rèn)識(shí)的不斷加深，外囊泡逐漸被認(rèn)為是細(xì)胞間通信、疾病診斷和預(yù)后的循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體，具有很高的臨床應(yīng)用潛質(zhì)。我們期待也相信未來(lái)會(huì)有更多的針對(duì)ADMSCs 及其外囊泡促進(jìn)成骨分化的研究，進(jìn)而服務(wù)于更多的骨質(zhì)疏松癥患者。

參·考·文·獻(xiàn)

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