申 強(qiáng),馬小玲,胡容峰,賀艷斌,宋麗華

(1 長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室,長治 046000;2 長治市人民醫(yī)院兒科;3 安徽中醫(yī)藥大學(xué);4 長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系化學(xué)教研室;5 長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:czmcslh@163.com)

冠狀病毒(coronavirus)是具有螺旋對稱的衣殼(nucleocapsid)和外套膜(envelope)結(jié)構(gòu)的正向單鏈RNA病毒[1,2]。眾所周知,冠狀病毒已成為重要的人類病原體,包括2003年發(fā)生在中國的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和2012年發(fā)生在阿拉伯半島的中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)等。2019年發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒是第7種被鑒定出的可引起人類感染的新型冠狀病毒(novel coronavirus),被世界衛(wèi)生組織(WHO)臨時(shí)命名為2019-nCoV。以上3種病毒均屬于β屬冠狀病毒[3]。進(jìn)化分析顯示,2019-nCoV與SARS-CoV和MERS-CoV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),基因序列一致性分別約為79%和50%[4]。大多數(shù)冠狀病毒引起上呼吸道感染,而SARS-CoV和MERS-CoV及這次的2019-nCoV可引起肺炎、甚至重癥肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19),且可在人際間傳播。鑒于2019-nCoV的高感染率和缺乏有效的治療方法,迫切需要開發(fā)一種針對2019-nCoV的有效抗病毒藥物。本文通過對抗2019-nCoV藥物作用機(jī)制方面的研究進(jìn)行綜述,以期對COVID-19的防治和抗病毒藥物的研發(fā)提供一些建設(shè)性意見。

1 新型冠狀病毒肺炎的感染機(jī)制

刺突糖蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒侵入細(xì)胞的主要介質(zhì),也是冠狀病毒宿主范圍的重要決定因素[5]。例如SARS-CoV的感染是通過S蛋白附著在受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)上[6]并隨后被宿主細(xì)胞蛋白酶,即Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(transmembrane protease serines, TMPRSS2)裂解而啟動(dòng)的[7-9],然后病毒通過早期和晚期的內(nèi)體,隨后是內(nèi)體/溶酶體運(yùn)輸。在此期間,宿主蛋白胞外蛋白酶(包括組織蛋白酶L)介導(dǎo)S蛋白在內(nèi)吞小泡中的進(jìn)一步切割[10-13],活化的S蛋白將活化病毒和細(xì)胞膜融合,并將SARS-CoV的基因組釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

ACE2是一種跨膜糖蛋白,在人的口鼻黏膜、肺、小腸、腎、膽管等多個(gè)組織和器官中均有表達(dá),主要分布在器官組織的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上[14,15],研究人員利用分子結(jié)構(gòu)模擬和模型計(jì)算的方法,對2019-nCoV的S蛋白和ACE2進(jìn)行結(jié)構(gòu)對接研究,發(fā)現(xiàn)兩種蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力,表明2019-nCoV可能通過其S蛋白與ACE2結(jié)合從而感染人呼吸道上皮細(xì)胞[16],此外,中國科學(xué)院武漢病毒所石正麗研究員團(tuán)隊(duì)[17]分別采用表達(dá)ACE2和不表達(dá)ACE2的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了2019-nCoV感染實(shí)驗(yàn),細(xì)胞染色的結(jié)果顯示2019-nCoV無法進(jìn)入不表達(dá)ACE2的HeLa細(xì)胞,但可以進(jìn)入表達(dá)人、中華菊頭蝠、麝貓和豬ACE2的HeLa細(xì)胞,說明ACE2很可能是2019-nCoV感染細(xì)胞的一個(gè)重要受體。

2 抗新型冠狀病毒肺炎藥物作用機(jī)制

2.1 氯喹

2020年1月25日,中國科學(xué)院武漢病毒研究所與軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院公布的聯(lián)合研究結(jié)果顯示:在Vero E6細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中[18],磷酸氯喹(chloroquine phosphate)的IC50抑制為1. 13 μmol/L,即0.58 μg/ml,說明在細(xì)胞水平上磷酸氯喹能有效抑制2019-nCoV的細(xì)胞進(jìn)入。截止2月15日,中國正在十多家醫(yī)院開展氯喹臨床研究,累計(jì)入組患者超過100例。臨床結(jié)果初步顯示,磷酸氯喹對COVID-19有一定的治療效果[18]。在2月19日國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中,抗病毒治療部分刪除“目前沒有確認(rèn)有效的抗新型冠狀病毒治療方法?！痹谠囉盟幬镏?增加了“磷酸氯喹(成人每次500 mg,每日2次)和阿比多爾(成人每次200 mg,每日3次)”等藥物[19]。

作為一款“老藥新用”的抗瘧疾藥,氯喹同時(shí)具有廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)的作用。與瑞德西韋(remdesivir)不同,因?yàn)槠渖鲜袝r(shí)間已久,無專利限制,在中國有多家藥企具備生產(chǎn)與銷售資質(zhì),可快速滿足臨床需求,且便于生產(chǎn)和存儲,藥物可及性更高,其毒副作用比洛匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)等抗HIV藥物更小,作為應(yīng)急藥物具有多重優(yōu)勢,加之臨床效果明確,成為疫情防控與患者治療“新的希望”。

氯喹的抗2019-nCoV的4種可能機(jī)制:①氯喹可通過干擾冠狀病毒受體蛋白ACE2的末端糖基化來削弱病毒與人體細(xì)胞受體的結(jié)合,抑制病毒的細(xì)胞侵入[20]。②氯喹化學(xué)結(jié)構(gòu)中的多個(gè)堿性基團(tuán),可提高病毒與細(xì)胞融合所需的內(nèi)體的pH值,能阻斷冠狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等pH依賴性病毒的復(fù)制[21]。③氯喹具有免疫調(diào)節(jié)作用,可減少免疫病理性損傷。氯喹可抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放,在2019-nCoV感染的中后期,TNF-α和IL-6濃度和疾病的嚴(yán)重性相關(guān),因此氯喹的抗炎作用也可減少免疫病理性損傷[22]。④氯喹通過與病毒蛋白水解酶PLpro(papain-like protease)結(jié)合,抑制冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,從而抑制病毒傳播、達(dá)到治療效果。另有兩種文獻(xiàn)中的氯喹機(jī)制,包括影響ACE2在細(xì)胞表面上的表達(dá),以及干擾病毒S蛋白的合成過程,已在實(shí)驗(yàn)中被排除[23]。

目前氯喹作用于冠狀病毒的具體機(jī)制還沒有充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬顯示氯喹可以穩(wěn)定結(jié)合于尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-表異位酶(UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase,GNE)的別構(gòu)位點(diǎn),GNE在唾液酸(sialic acid)的生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而唾液酸參與SARS-CoV表面受體ACE2的糖基化過程,因此氯喹可能通過抑制GNE對唾液酸的合成來影響ACE2糖基化,從而發(fā)揮抗2019-nCoV病毒的作用;同時(shí)氯喹也可以穩(wěn)定地與PLpro結(jié)合,抑制病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制,實(shí)現(xiàn)治療效果[16,24-27]。

2.2 阿比多爾

阿比多爾是前蘇聯(lián)研制的一種光譜抗病毒非處方(OTC)藥物,毒性較低(LD50>4 g/kg),可用于防治流感,也可用于防治SARS(IC50為5.26 μg/ml)和MERS冠狀病毒[28-30]、鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他引起急性呼吸道病毒感染的病毒。2020年2月4日,李蘭娟院士團(tuán)隊(duì)公布了阿比多爾體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:阿比多爾在10-30 μmol/L濃度下,與藥物未處理的對照組比較,能有效抑制2019-nCoV達(dá)到60倍,并且顯著抑制病毒對細(xì)胞的病變效應(yīng)。但目前阿比多爾(abidor)抗2019-nCoV的作用機(jī)制尚不十分清楚。

已知的阿比多爾抗病毒作用機(jī)制:①阻止病毒入胞:阿比多爾通過干擾網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞作用來抑制病毒進(jìn)入[31];阿比多爾抑制病毒脂膜-內(nèi)體泡膜的融合,發(fā)揮膜融合抑制作用[32]。②誘生干擾素:阿比多爾通過激活2,5-寡聚腺苷酸合成酶(OAS),誘導(dǎo)干擾素生成,降解病毒mRNA,阻止病毒復(fù)制。其具有強(qiáng)烈的誘生干擾素作用,可在較短時(shí)間(24 h)誘導(dǎo)呼吸道局部黏膜產(chǎn)生足量干擾素,并于第4天在呼吸道局部形成廣譜抗病毒狀態(tài)。提高機(jī)體免疫功能和吞噬病毒的能力,比注射疫苗產(chǎn)生作用的時(shí)間(一般為14 d)更快[33]。③提高機(jī)體免疫:阿比多爾可激活吞噬細(xì)胞,增強(qiáng)非特異性免疫[34]。阿比多爾對免疫低下患者的多項(xiàng)免疫學(xué)參數(shù)(CD4+、CD8+、B細(xì)胞及血清免疫球蛋白)均有明顯的改善作用[35]。

阿比多爾用于治療流感10余年,目前尚無耐藥報(bào)道,未在人群中發(fā)現(xiàn)耐藥株,可見阿比多爾與單靶點(diǎn)抗病毒藥不同,有多種抗病毒的機(jī)制。但這些都還有待研究。

2.3 利巴韋林

利巴韋林(ribavirin,病毒唑)是具有廣譜抗病毒作用的嘌呤核苷類似物,可能具有多種作用機(jī)制,包括致死性誘變、專性或非專性鏈終止、以及通過抑制肌苷酸-5-磷酸脫氫酶的合成(其靶點(diǎn)為RdRp),阻斷肌苷酸轉(zhuǎn)化為鳥苷酸,從而阻止RNA和DNA病毒的復(fù)制,這條反應(yīng)鏈的最后一步是RNA基因突變最致命最關(guān)鍵的一步[36]。因此利巴韋林在臨床上具有良好的抗病毒作用,對DNA病毒和RNA病毒均有抑制復(fù)制作用。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中,推薦使用利巴韋林(建議與干擾素或洛匹那韋/利托那韋聯(lián)合應(yīng)用,成人500 mg/次,每日2-3次靜脈輸注)[19]。

2.4 洛匹那韋/利托那韋

洛匹那韋是人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)蛋白酶抑制劑,常與利托那韋聯(lián)用,通過利托那韋抑制細(xì)胞色素P450酶代謝來增加洛匹那韋半衰期。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,洛匹那韋/利托那韋能夠一定程度抑制冠狀病毒復(fù)制[37]。我國學(xué)者利用絨猴動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn),洛匹那韋/利托那韋和干擾素-β聯(lián)用治療MERS-CoV感染,比對照組療效更好[37]。該藥在2019-nCoV感染患者中的療效和安全性的臨床隨機(jī)對照研究(ChiCTR2000029308)目前正在進(jìn)行中?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第六版)》中建議的給藥方案是洛匹那韋/利托那韋(成人400 mg/100 mg,每日2次)[19]。

2.5 氨溴索

氨溴素(ambroxol,沐舒坦)系黏液溶解劑,作為一種已在臨床應(yīng)用許久的藥物,安全性較高,其不僅具有化痰、排痰作用,氨溴素大劑量使用還可刺激呼吸道Ⅱ型肺泡細(xì)胞合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì),還具有抗氧化、抗炎作用,且其可預(yù)防和治療肺纖維化。尤其是氨溴索作為潛在的ACE2受體結(jié)合劑之一[38],對2019-nCoV的預(yù)防或減輕其造成急性肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),以及減緩腎臟及心臟損傷,提供了有益的治療思路。因此氨溴素也被推薦為治療COVID-19用藥之一。

氨溴索防治COVID-19的3種可能機(jī)制:①氨溴素可促Ⅱ型肺泡細(xì)胞合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)。表達(dá)ACE2的Ⅱ型肺泡很可能是2019-nCoV感染的靶細(xì)胞,而氨溴素刺激呼吸道Ⅱ型肺泡細(xì)胞合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)的作用,可防止肺部炎癥損傷、維持肺泡結(jié)構(gòu)[38],對2019-nCoV所致ARDS起重要防治作用。且研究顯示,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)ARDS時(shí),肺泡巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞被激活,肺內(nèi)源性氧化劑的產(chǎn)生增加,因此產(chǎn)生大量的氧自由基,而氨溴索則可以通過抑制超氧化物陰離子、過氧化氫的生成,來減輕氧化應(yīng)激損傷。②氨溴索有抗肺纖維化作用。氨溴素可以抑制細(xì)胞因子及花生四烯酸產(chǎn)物的生成,減輕中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的釋放和聚集,起到抗炎作用,從而減緩肺部纖維化進(jìn)程[39]。③作為可能的ACE2結(jié)合劑,氨溴索可抑制病毒刺突S蛋白與細(xì)胞ACE2受體的結(jié)合,從而抑制2019-nCoV的細(xì)胞侵入[38]。

2.6 瑞德西韋

美國第1例COVID-19患者在接受了瑞德西韋的藥物靜脈輸注后,體溫迅速恢復(fù)正常,呼吸困難癥狀明顯減輕,不再需要吸氧,只剩少許干咳和流鼻涕癥狀[40],該論文發(fā)表時(shí),該患者雖仍在住院觀察,但癥狀已經(jīng)明顯好轉(zhuǎn)。瑞德西韋是由吉利德公司開發(fā)的一種核苷類似物,主要是作為抗埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和馬爾堡病毒(Marburg virus)的試驗(yàn)藥物,目前在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型試驗(yàn)中對MERS-CoV和SARS-CoV均具有抗病毒活性[41],對于同為冠狀病毒的2019-nCoV,最近的研究也表明瑞德西韋在體外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出抑制活性,IC50值為0.77 μmol/L[18]。目前,瑞德西韋還未通過完整的臨床試驗(yàn),尚未在任何國家獲得批準(zhǔn)上市,其在人體內(nèi)的實(shí)際效果和安全性仍有待評估。2月5日,中日友好醫(yī)院與武漢市金銀潭醫(yī)院啟動(dòng)了瑞德西韋治療新型冠狀病毒感染的雙盲試驗(yàn)臨床研究,被納入臨床試驗(yàn)的患者共計(jì)761例其中輕、中癥患者共計(jì)308例,重癥患者453例。

冠狀病毒因3′-5′核酸外切酶特性使得多種核苷類似物無有效抗病毒活性,而瑞德西韋通過完整的核糖核酸外切酶校對可有效地抑制冠狀病毒,其三磷酸化后的產(chǎn)物與三磷酸腺苷(ATP)競爭抑制RNA聚合酶(RNA-derived RNA polymerase,RdRp)的活性,特別是呼吸道合胞病毒(RSV)聚合酶的的活性,在人體多種細(xì)胞中代謝合成具有活性的核苷三磷酸(NTP),NTP作為替代底物,通過與新生病毒的RNA鏈結(jié)合,致使病毒早熟而終止[42,43]。

2.7 替考拉寧

替考拉寧(teicoplanin)是一種糖肽類抗生素,研究發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制埃博拉病毒、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV假病毒的細(xì)胞進(jìn)入[44,45]。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,替考拉寧可通過特異性抑制組織蛋白酶L的活性來阻斷病毒的進(jìn)入,可作為組織蛋白酶L依賴性病毒的潛在抑制劑。這為2019-nCoV感染的防治提供了可能的策略。

此外,該研究[45]在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)包括替考拉寧和達(dá)巴萬星(dalbavancin)在內(nèi)的幾種糖肽類抗生素對組織蛋白酶L表現(xiàn)出特異性抑制作用,達(dá)巴萬星以劑量依賴性方式抑制2019-nCoV的細(xì)胞進(jìn)入。但是,另一種常用抗生素萬古霉素并沒有抑制2019-nCoV的進(jìn)入,結(jié)果與先前幾種糖肽類抗生素對SARS-CoV和MERS-CoV的抑制作用一致。

替考拉寧血漿半衰期長,給藥方便,主要用于由革蘭氏陽性細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌和鏈球菌)引起的嚴(yán)重感染。臨床上用于抑制革蘭氏陽性菌的替考拉寧的推薦血漿濃度為15 mg/L,即8.78 μmol/L,常用劑量為400 mg/d。該研究發(fā)現(xiàn)其對2019-nCoV的IC50抑制僅為1.66 μmol/L,這遠(yuǎn)低于常規(guī)臨床藥物濃度。因此,常規(guī)劑量(400 mg/d)可考慮用于2019-nCoV感染的患者。如果效果不明顯,則由于毒性低,可以優(yōu)化劑量?？梢钥紤]使用800 mg/d或1 200 mg/d的劑量來提高藥物效率。鑒于抗病毒治療的原則是盡早預(yù)防病毒感染和擴(kuò)增,因此該研究建議在早期就將替考拉寧用于COVID-19?；蛘咚梢源嫒f古霉素或其他抗生素在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候治療革蘭氏陽性細(xì)菌的合并感染。因此,替考拉寧可作為2019-nCoV感染和與革蘭氏陽性細(xì)菌共感染的雙重抑制劑。

3 新型冠狀病毒肺炎的中醫(yī)藥治療

中醫(yī)認(rèn)為新冠肺炎為“寒濕疫”,國家衛(wèi)健委和中醫(yī)藥管理局推薦在中西醫(yī)結(jié)合救治新冠肺炎中使用“清肺排毒湯”[19]。清肺排毒湯來源于漢代張仲景所著《傷寒雜病論》中的多個(gè)治療由寒邪引起的外感熱病的經(jīng)典方劑組合,是仲景相關(guān)經(jīng)方融合創(chuàng)新運(yùn)用。此方為麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯、五苓散巧妙相合,性味平和?？捎糜谥委?019-nCoV感染的肺炎輕型、普通型、重型患者,在危重癥患者救治中也可結(jié)合患者實(shí)際情況合理使用。該方也可用于普通感冒和流感患者?！胺窝字嗅t(yī)藥有效方劑篩選研究”專項(xiàng)在山西、河北、黑龍江、陜西四省試點(diǎn)開展清肺排毒湯救治新型冠狀病毒感染的肺炎患者臨床療效觀察,據(jù)統(tǒng)計(jì),截至2020年2月5日,4個(gè)試點(diǎn)省份運(yùn)用清肺排毒湯救治確診病例214例,3 d為一個(gè)療程,總有效率達(dá)90%以上,其中60%以上患者癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)改善明顯,30%患者癥狀平穩(wěn)且無加重。

現(xiàn)將“清肺排毒湯”從中醫(yī)理論“復(fù)方”角度作一分析:清肺排毒湯既祛寒閉又利小便祛濕,麻黃可增五苓散祛濕,五苓散控制麻桂發(fā)汗之峻,桂枝甘草辛甘化陽扶正,苓桂術(shù)甘又有健脾化飲之用,因新冠肺炎胸憋氣短,雖無明顯喘,其實(shí)肺閉不宣,比有喘咳更為嚴(yán)重,又合用射干麻黃湯及橘枳姜湯,小柴胡湯為少陽病,半表半里,又可通利三焦,既防疫邪入里,又調(diào)肝和胃,顧護(hù)消化功能,加藿香為芳香化濕,用石膏防郁而化熱。

4 回顧與展望

綜上,目前關(guān)于2019-nCoV病毒的研究還不十分清楚,對于相關(guān)藥物的作用機(jī)制和治療效果也有待進(jìn)一步深入研究和考證。但是利用分子對接結(jié)合自由能計(jì)算和深度學(xué)習(xí)模型等計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),已經(jīng)找到了一些針對2019-nCoV的潛在抑制劑。通過分析文獻(xiàn)可以看出,以2019-nCoV上高度保守復(fù)制的基因序列為基礎(chǔ),針對S蛋白和ACE2受體,或RNA切割和復(fù)制的主要蛋白酶(Mpro),TMPRSS2,組織蛋白酶L,糜蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro),類木瓜蛋白酶(PLpro)和RdRp等為靶點(diǎn)開發(fā)抗病毒藥物可能是未來研究的方向。在此基礎(chǔ)上,積極開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及藥物臨床試驗(yàn)。

鑒于炎癥組織的低pH特性和病毒復(fù)制的pH依賴性,未來可以在酸響應(yīng)性靶向納米給藥系統(tǒng),肺泡表面活性物質(zhì)類似物等方面開展藥學(xué)研究,以提高抗2019-nCoV藥物的靶向性和生物利用度,進(jìn)一步促進(jìn)對COVID-19感染的有效治療。