程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)[1]數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)2018年新發(fā)癌癥患者達(dá)428.5萬(wàn)例。隨著腫瘤治療學(xué)的進(jìn)步，癌癥患者的生存率有了極大提高。與此同時(shí)，年輕癌癥患者在臨床痊愈后對(duì)生育要求也越來(lái)越迫切，78.3%～90.0%的年輕癌癥患者有生育及再生育的強(qiáng)烈需求[2]。放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)和細(xì)胞毒類抗癌藥物的應(yīng)用在挽救癌癥患者生命的同時(shí)，難以避免地造成卵巢功能不可逆的損傷[3]。接受10～15 Gy照射劑量的青春期前女孩未來(lái)發(fā)生早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的風(fēng)險(xiǎn)為30%～70%，高劑量烷化劑的應(yīng)用使化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)后閉經(jīng)的發(fā)生率高達(dá)40%～80%[4-5]，骨髓移植患者POI發(fā)生率可高達(dá)70%～100%，故生育力保護(hù)非常重要。

對(duì)于需要接受性腺毒性療法的女性，可以選擇多種生育力保存方法，即胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存和卵巢組織凍存，卵巢組織凍存是近年全球防治醫(yī)源性POI的一種重要的生育力保護(hù)方法[6-7]，可在一片組織中保存成百上千個(gè)卵細(xì)胞，不依賴于患者的生理周期，無(wú)須超促排卵，不會(huì)延誤癌癥的最佳治療時(shí)間，不僅能夠有效保存患者生育力，還能在一定程度上恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能[8]，是青春期前女孩和需要立即抗癌治療患者的唯一選擇[9]。全球已有超過(guò)145個(gè)活產(chǎn)嬰兒通過(guò)此技術(shù)誕生[10]，在過(guò)去10年中嬰兒出生數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，研究[11]顯示高達(dá)95%的患者移植后卵巢功能恢復(fù)，但僅63%的卵巢組織移植后能存活1年，由于卵巢組織移植沒(méi)有血管吻合，因此移植物經(jīng)歷了缺氧和局部缺血的過(guò)程，持續(xù)3～5 d才能觀察到進(jìn)行性血管重建，從第7天開始可以看到功能性血管[12]，從第10天開始可以進(jìn)行有氧代謝重建，卵巢組織在移植后的早期有很多卵泡丟失[13]，因此移植需要進(jìn)一步優(yōu)化。本文主要從應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)化凍融卵巢組織移植，改善凍存卵巢組織移植早期低氧期卵泡丟失等的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 卵巢組織凍存移植后早期低氧期損傷

卵巢組織凍存是一項(xiàng)工作密集型的技術(shù)，包括卵巢取材手術(shù)、組織的處理、冷凍和長(zhǎng)期保存，移植物必然是一種非常有限的資源，而且對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，往往是一種最后的選擇，因此減少卵泡丟失，從而在移植物中保留盡可能多的原始卵泡很重要。對(duì)新鮮和凍融卵巢組織比較的研究[14]顯示，卵泡存活率和功能相似。卵巢組織凍存移植過(guò)程丟失的卵泡中，據(jù)估計(jì)至少有75%是在移植過(guò)程中丟失，因?yàn)橐浦参镌谛碌沫h(huán)境中重新血管化并恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，因此移植后的優(yōu)化工作可能會(huì)對(duì)最終的卵泡儲(chǔ)備產(chǎn)生很大的影響。

1.1 卵巢移植后早期卵泡的丟失

竇狀卵泡在卵巢處理過(guò)程中會(huì)被機(jī)械地去除，較小的生長(zhǎng)卵泡因極易受到冷凍和復(fù)蘇的影響可能會(huì)在凍存復(fù)蘇過(guò)程中丟失。移植后卵泡丟失的機(jī)制主要是缺血和激活，移植物中卵泡的存活依賴于缺血、缺氧初期新生血管組織，移植物在低氧環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣由周圍組織通過(guò)擴(kuò)散提供，時(shí)間約為3～5 d[11]，在血運(yùn)重建能夠?yàn)橐浦参锾峁┏浞值难鯕夂蜖I(yíng)養(yǎng)前，時(shí)間可能需要長(zhǎng)達(dá)7～10 d[15]。在血管生成期，移植物受到缺血再灌注損傷，導(dǎo)致炎性反應(yīng)介質(zhì)、自由基和活性氧的產(chǎn)生[16]，缺血再灌注損傷主要通過(guò)影響生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞導(dǎo)致卵泡丟失，而原始卵泡由于處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞代謝率較低，比較不容易受到缺血損傷的影響，在血管化較差的卵巢外側(cè)皮質(zhì)中，它們習(xí)慣于相對(duì)低氧的環(huán)境[17]。原始卵泡在移植物中過(guò)度募集可能是由于組織處理、凍融以及移植后缺血導(dǎo)致生長(zhǎng)卵泡的廣泛丟失所致，生長(zhǎng)中的卵泡通過(guò)分泌抑制因子，主要是抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)在抑制原始卵泡激活方面起著重要作用[18]。移植后立即發(fā)生的原始卵泡大量丟失同時(shí)伴隨著早期生長(zhǎng)卵泡數(shù)量的顯著增加和過(guò)渡性和早期生長(zhǎng)卵泡顆粒細(xì)胞增生的增加[14, 19]。在卵巢組織移植患者中，早期也觀察到AMH顯著升高，隨后恢復(fù)到低水平，有時(shí)檢測(cè)不到[20]。

Hippo信號(hào)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號(hào)是原始卵泡激活的主要調(diào)節(jié)信號(hào)[21]，有研究[22]通過(guò)卵巢碎片化或藥物治療，包括第10號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)抑制劑和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激活劑通過(guò)破壞Hippo信號(hào)來(lái)促進(jìn)體外原始卵泡的激活，從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)，以便能夠用于體外受精(in vitro fertilization, IVF)，這也就是體外激活(in vitro activation, IVA)。卵泡激活的多少直接影響移植物的原始卵泡的儲(chǔ)備，移植物中原始卵泡的誘導(dǎo)激活在短期內(nèi)增加了生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量，但導(dǎo)致移植物壽命縮短，這可能適用于立即獲取成熟卵泡體外受精，但犧牲了移植物的整體生育潛力和長(zhǎng)期的內(nèi)分泌功能。對(duì)51例POI患者進(jìn)行了IVA，總共有5例(10%)妊娠和3例(6%)活產(chǎn)。一般來(lái)說(shuō)，POI患者自然妊娠率為5%～10%，因此IVA的成功率可能低于完全不干預(yù)的效果[23]。卵巢組織凍存移植目前主要用于癌癥患者，一旦病情臨床痊愈后，會(huì)將卵巢組織自體移植，移植目的是盡可能長(zhǎng)時(shí)間地恢復(fù)卵巢功能，通過(guò)激活失去大量原始卵泡會(huì)適得其反[24]。相比之下，IVA目前目標(biāo)是針對(duì)卵巢儲(chǔ)備極低，對(duì)控制性卵巢刺激反應(yīng)差的女性，加速激活的目的是在移植后立即刺激少數(shù)剩余的卵泡生長(zhǎng)[25]。

1.2 卵巢組織移植后的功能

目前卵巢組織移植后95%的患者能恢復(fù)卵巢功能，但移植物存活時(shí)間各不相同[26]，某些情況下單次移植物可維持功能數(shù)年，連續(xù)妊娠多達(dá)4次，而其他移植物可能在幾個(gè)月內(nèi)停止功能，決定移植物壽命的是移植后移植物中存活下來(lái)的原始卵泡的最終數(shù)量，分析卵泡丟失的原因?qū)τ谧畲笙薅妊娱L(zhǎng)移植物壽命和優(yōu)化卵巢組織凍存移植技術(shù)是必要的[27]。

卵巢移植物中成熟血管的快速形成對(duì)于限制缺血性損傷和移植后高比例卵泡儲(chǔ)備的耗竭非常重要?？紤]到移植后存活的卵泡數(shù)量減少，但卵巢移植物確實(shí)可以存活數(shù)年，從而可用于重復(fù)懷孕和活產(chǎn)。在人類生殖過(guò)程中，卵泡激活和喪失的速率是非線性的，受卵巢內(nèi)外信號(hào)的調(diào)節(jié)，控制著招募、生長(zhǎng)、選擇和閉鎖速率之間的復(fù)雜相互作用[28]。卵巢內(nèi)對(duì)卵泡募集的調(diào)節(jié)包括PI3K-PTEN通路、KIT配體、AMH、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)蛋白家族成員等。此外，研究[29]顯示卵巢的結(jié)構(gòu)和原始卵泡的密度起著自我調(diào)節(jié)的作用，因此休眠卵泡池的減少會(huì)降低招募的速度。卵巢外因素的影響在研究[30]中也得到了證實(shí)，接受單側(cè)卵巢切除術(shù)的患者，其絕經(jīng)年齡僅比正常絕經(jīng)年齡早1～2年，在卵巢儲(chǔ)備降低的情況下，身體調(diào)整卵泡重新募集率以保存卵泡的這種能力，也可能在卵巢移植中發(fā)揮作用。在移植急性期后，卵巢內(nèi)外的調(diào)節(jié)因子都可能通過(guò)調(diào)節(jié)招募速率來(lái)識(shí)別和響應(yīng)移植物的有限儲(chǔ)備，以減少卵泡激活和丟失，并最大限度地延長(zhǎng)移植物的壽命。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可以分離自骨髓、外周血、牙髓和臍帶，MSCs具有分化為幾種細(xì)胞譜系的能力，例如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，眾所周知，MSCs在組織再生、血管生成和傷口修復(fù)上具有很大的能力[31]，不論來(lái)源如何，MSCs都通過(guò)分泌各種生物活性分子和細(xì)胞因子來(lái)支持細(xì)胞增生和存活[32]。MSCs的再生和抗凋亡作用是由于它們大量的生物活性分子，包括角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, FGF)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)，BMP-4，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)等，它們是重要的卵泡生成調(diào)節(jié)劑[33]。根據(jù)MSCs與共培養(yǎng)細(xì)胞之間的交互作用，利用MSCs作為飼養(yǎng)細(xì)胞提供了長(zhǎng)期且適當(dāng)?shù)呐苑置跔I(yíng)養(yǎng)因子來(lái)源。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCMSCs)是一種有前途的干細(xì)胞來(lái)源，用于基于細(xì)胞的治療[34]。在多種疾病模型中，如糖尿病[35]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[36]等，UCMSCs已顯示出通過(guò)免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)組織修復(fù)，并且UCMSCs已在臨床上用于治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy of newborn, HIE)[37]。

脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)最早由Zuk等[38]描述，從人脂肪抽吸物中分離出并構(gòu)成具有多種譜系分化能力的MSCs。由于采用微創(chuàng)手術(shù)易于收獲脂肪以及細(xì)胞密度高，它們?cè)谠偕t(yī)學(xué)中的應(yīng)用正在普及。實(shí)際上，目前正在進(jìn)行或已經(jīng)完成了許多評(píng)估ASCs安全性和有效性的臨床試驗(yàn)(Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ期)[39]，對(duì)研究[40-41]，已證實(shí)了它們具有多系分化潛能、通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子并分化為功能性血管來(lái)促進(jìn)血管生成的能力。ASCs的自分泌/旁分泌因子稱為分泌體(secretome)，參與受損組織的再生過(guò)程，誘導(dǎo)血管生成，減少細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，分泌體可能是一種新的細(xì)胞療法，治療效果與注射活細(xì)胞相當(dāng)，甚至優(yōu)于注射活細(xì)胞，稱為無(wú)細(xì)胞療法(cell-free therapy)[42]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞在卵巢組織移植中應(yīng)用的研究

在過(guò)去的十年中，卵巢組織移植的主要挑戰(zhàn)之一是延長(zhǎng)移植組織的壽命和質(zhì)量，以便為希望懷孕的癌癥幸存者提供改善妊娠結(jié)局的機(jī)會(huì)。異種移植模型研究[43]采用生長(zhǎng)因子(growth factor, GF)如VEGF，抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸[44]、促紅細(xì)胞生成素[45]、維生素E、褪黑激素和類固醇激素等方法，但迄今為止，尚未見到可向臨床轉(zhuǎn)化的顯著改善，還有在食蟹猴自體卵巢移植模型中研究了在移植之前準(zhǔn)備血管床[46]。有研究[47-48]采用各種來(lái)源的MSCs，利用其促血管生成、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)特性，2018年Manavella等[49]描述了一種利用ASCs促進(jìn)異種移植人卵巢組織血運(yùn)重建的方法，在卵巢組織移植前兩周采用高濃度ASCs來(lái)提前準(zhǔn)備移植部位，可以提高移植物內(nèi)部的氧合和血運(yùn)重建率，并提高卵泡存活率和減少細(xì)胞凋亡。Manavella等[49]觀察到移植后7 d卵泡平均存活率為62%，與添加ASCs相關(guān)的早期血管化和氧合增加可以解釋卵泡丟失的減少。采用ASCs的移植程序是朝著潛在解決卵巢組織移植后大量卵泡丟失問(wèn)題邁出的有希望的一步?？傊?，證明了在移植后早期卵巢組織的含氧和血管形成率更高，這與增加的卵泡存活率和減少的細(xì)胞凋亡相關(guān)。未來(lái)的研究應(yīng)集中于闡明卵巢組織移植中MSCs的作用機(jī)制，以期于臨床應(yīng)用[50]。

臨床前實(shí)驗(yàn)[51]表明，缺氧處理的ASCs在創(chuàng)面愈合、心肌細(xì)胞再生和軟骨修復(fù)等方面具有較好的效果，表明其在缺血性疾病和軟骨缺損的治療方面具有巨大的應(yīng)用潛力，低氧處理的MSCs可能會(huì)減少卵巢組織移植早期的卵泡丟失。研究[52]顯示，缺氧對(duì)包括ASCs在內(nèi)的MSCs的有益作用主要?dú)w因于低氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-inducible factor -1a, HIF-1a)，缺氧上調(diào)HIF-1a，進(jìn)而增強(qiáng)MSCs的活性、 增生、可溶性因子的分泌、軟骨形成潛能、遷移和植入潛能。在常氧條件下，HIF-1α被抑癌基因產(chǎn)物泛素化，翻譯后被胞質(zhì)中的蛋白酶體降解，抑制HIF-1α介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。但缺氧條件下，HIF-1α與血管緊張素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合受到抑制，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定并移位到細(xì)胞核內(nèi)。HIF-1α與HIF-1β發(fā)生二聚反應(yīng)，形成HIF-1復(fù)合物，該復(fù)合體將與靶基因啟動(dòng)子中稱為缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-responsive elements, HREs)的DNA序列結(jié)合。關(guān)于低氧條件培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞后與卵巢組織共移植是否可促進(jìn)卵泡的存活和減少凋亡尚未見報(bào)道。

4 小結(jié)與展望

卵巢組織凍存移植作為一種生育力保護(hù)方法，被越來(lái)越多地用于性腺毒性治療的年輕女性，世界各地也出現(xiàn)越來(lái)越多的懷孕和活產(chǎn)。卵巢組織移植的目標(biāo)是盡可能長(zhǎng)時(shí)間地恢復(fù)卵巢功能，以實(shí)現(xiàn)多次排卵和妊娠，并恢復(fù)內(nèi)分泌功能。因此優(yōu)化的重點(diǎn)在于減少移植物中的卵泡損失，以此作為延長(zhǎng)移植物壽命和生育力的基礎(chǔ)。減少缺血損傷和/或減少卵泡激活的藥理學(xué)方法可以潛在地減少移植后的卵泡丟失，目前研究[50-52]表明間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)移植物的血管形成，減少卵泡的損耗，從而提高移植物的存活時(shí)間，為患者提供更大的長(zhǎng)期獲益，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究其作用機(jī)制，以及研究低氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞是否更加優(yōu)化卵巢組織移植。