蔣明霞 晁秀珍 王兆芬 馬斌忠 馬永成 王蓉 王朝才 李爾琛 魏於家 李詠雪 張琪

據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織報(bào)告， 2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者估算約1000萬例，耐多藥和(或)單耐利福平結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者56萬例。中國新發(fā)結(jié)核病患者約90萬例，MDR/RR-TB患者7.3萬例[1]。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)增大了治療難度，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國結(jié)核病患病率呈現(xiàn)西部高于中部、中部高于東部的特征，結(jié)核病總耐藥率為36.8%，耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)占6.8%[2]。青海省平均海拔3000米以上，南部(以下簡稱“青南地區(qū)”)平均海拔超過4000米，面積占全省總面積的一半以上，氣溫偏低，以藏族、蒙古族為主要民族，以農(nóng)、牧業(yè)為主。為掌握青南高寒地區(qū)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)耐藥類型及分布情況，為改進(jìn)牧業(yè)區(qū)結(jié)核病防治措施提供依據(jù)，筆者對(duì)我省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室收集的154株MTB進(jìn)行耐藥性分析。

資料和方法

一、 菌株來源

1.菌株的選?。菏占嗄系貐^(qū)(玉樹州、果洛州、黃南州)市/州級(jí)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室2018—2019年全部518例病原學(xué)陽性患者的標(biāo)本，進(jìn)行分離培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)和菌種鑒定，最終經(jīng)菌種鑒定的MTB菌株為154株。其中，玉樹州44株、果洛州12株、黃南州98株；男性95株，女性59株；年齡分布在13～79歲之間，中位年齡27歲。

2.菌株分離：依據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[3]，應(yīng)用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行痰分枝桿菌分離培養(yǎng)。痰標(biāo)本采用4% NaOH去污染處理后直接接種至酸性羅氏固體培養(yǎng)基上，接種后第3天和第7天觀察培養(yǎng)情況，然后每周觀察1次，直到第8周末。

3.菌種鑒定：分離株在進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)的同時(shí)，利用對(duì)硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)初步鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌，排除非結(jié)核分枝桿菌。

二、 研究方法

1.主要試劑：改良羅氏培養(yǎng)基、藥物敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基、PNB培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

2.藥物敏感性試驗(yàn)：藥物敏感性試驗(yàn)操作參考《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]中的比例法，對(duì)異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、鏈霉素(streptomycin，Sm)、卡那霉素(kanamycin，Km)、氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)6種抗結(jié)核藥品進(jìn)行敏感性測(cè)定。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基表面菌落數(shù)之比≥0.01判斷為耐藥。

三、質(zhì)量控制

每批試驗(yàn)均以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為對(duì)照。省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室人員和市/州級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室人員每年均參加國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的全國抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)熟練度測(cè)試并獲得優(yōu)秀和合格證書，保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)性和質(zhì)量。

四、耐藥結(jié)核病評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

單耐藥結(jié)核病(mono-resistant tuberculosis, MR-TB)、多耐藥結(jié)核病(poly-resistant tuberculosis, PR-TB)、MDR-TB、準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis, Pre-XDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)、利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB)6種耐藥類型,參考中國防癆協(xié)會(huì)《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2019年簡版)》[1]的概念。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Excel 2010軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用“率 (%)”表示,以χ2檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 不同地區(qū)耐藥類型與耐藥率

154株MTB菌株中全敏感菌株97株，耐藥菌株57株，總耐藥率為37.01%(57/154)，單耐藥率為23.38%(36/154),多耐藥率為3.25%(5/154), 耐多藥率為10.39%(16/154)，利福平耐藥率為18.18%(28/154)，廣泛耐藥率為0.00%。不同地區(qū)總耐藥率、單耐藥率、多耐藥率、耐多藥率、利福平耐藥率的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.21、72.00、5.00、22.49、27.15，P值均<0.05)，3個(gè)地區(qū)均為黃南州的耐藥率高于玉樹州和果洛州。見表1。

二、 初、復(fù)治耐藥類型與耐藥率

初、復(fù)治患者總耐藥率相比，復(fù)治患者明顯高于初治患者。復(fù)治患者的總耐藥率、單耐藥率、耐多藥率、利福平耐藥率明顯高于初治患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=123.00、28.12、11.68、24.07，P值均<0.05)，復(fù)治患者的多耐藥率與初治患者多耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.00，P>0.05)。見表2。

三、 任何耐藥率情況

6種抗結(jié)核藥品的任何耐藥率為69.48%(107/154)，由高到低依次為：異煙肼(24.68%,38/154)>利福平(18.18%,28/154)>鏈霉素(11.04%,17/154)>氧氟沙星(8.44%,13/154)>乙胺丁醇(5.84%,9/154)>卡那霉素(1.30%,2/154)。

四、 不同社會(huì)學(xué)特征患者耐藥情況分析

154例患者的性別(χ2=57.00，P<0.01)、年齡(χ2=118.51，P<0.01)、民族(χ2=288.37，P<0.01)和職業(yè)(χ2=371.17，P<0.01)的總耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

討 論

在全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中,中國的結(jié)核病死亡率為2.6/10萬，結(jié)核病死亡率排在30個(gè)高負(fù)擔(dān)國家中的第29位，僅高于巴西[6]。耐藥結(jié)核病，尤其MDR-TB是全世界面臨的巨大挑戰(zhàn)，MDR-TB治愈率低，約為50%[7-8]，病死率卻高達(dá)52%[9]。據(jù)2010年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，西部地區(qū)結(jié)核病疫情嚴(yán)重，患病率高達(dá)695/10萬，高于全國平均水平[2]。2009—2012年青海省在農(nóng)、牧民中發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者10 393例，占全部活動(dòng)性肺結(jié)核患者總數(shù)的73.62%，提示農(nóng)牧區(qū)的活動(dòng)性、涂陽和菌陽肺結(jié)核患病率高于城鎮(zhèn)[10]。

表1 青南地區(qū)MTB臨床分離菌株的耐藥類型分布[耐藥株數(shù)(耐藥率，%)]

表2 初、復(fù)治患者M(jìn)TB臨床分離株的耐藥類型分布[耐藥株數(shù)(耐藥率，%)]

表3 不同社會(huì)人口學(xué)特征患者耐藥情況分布[耐藥株數(shù)(耐藥率，%)]

本研究結(jié)果顯示，青南地區(qū)結(jié)核病患者總耐藥率為37.01%，耐多藥率為10.39%；復(fù)治患者總耐藥率為64.52%，復(fù)治患者耐多藥率為35.48%，分別高于全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果(36.8%、6.8%；35.9%、15.4%)[2]?？偰投嗨幝蕿?0.39%，復(fù)治患者耐多藥率為35.48%，初治患者耐多藥率為4.07%；復(fù)治患者耐多藥率遠(yuǎn)高于全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果，初治患者耐多藥率略低于全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果(分別為15.4%、5.4%)[2]。復(fù)治患者耐多藥率遠(yuǎn)高于初治患者，原因可能一方面與長期服用以異煙肼和利福平為主要方案的抗結(jié)核藥品有關(guān)，增加了MTB耐藥性的產(chǎn)生。另一方面可能因?yàn)樘幱谄h(yuǎn)地區(qū)，經(jīng)濟(jì)條件相對(duì)比較落后，很多農(nóng)牧民族在發(fā)現(xiàn)得了結(jié)核病后在藥店自行購買藥品，癥狀有所緩解后便停藥，服藥很不規(guī)范; 當(dāng)知道結(jié)核病的免費(fèi)政策后到疾病預(yù)防控制中心(或定點(diǎn)醫(yī)院)就診，也不能按時(shí)服藥，造成大量耐藥患者的發(fā)生[11]。因此，筆者認(rèn)為對(duì)青南地區(qū)應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)耐藥結(jié)核病患者的歸口管理，規(guī)范合理臨床用藥，控制耐藥性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

利福平耐藥涵蓋所有對(duì)利福平耐藥的情況，包括單耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥[12]。2007—2018年的研究結(jié)果顯示，初治患者利福平耐藥率為6.6%，復(fù)治患者利福平耐藥率為30.0%；2013年初治患者利福平耐藥率為7.1%，復(fù)治患者利福平耐藥率為24.0%；高于全球初治和復(fù)治患者利福平耐藥率(3.6%、17.0%)[13]。本次研究結(jié)果顯示利福平耐藥率為18.18%，其中初治患者為13.01%，復(fù)治患者為38.71%，高于2007—2018年和2013年兩次全國耐藥基線調(diào)查結(jié)果，提示該地區(qū)利福平耐藥結(jié)核病疫情非常嚴(yán)重。楊儀等[14]認(rèn)為，利福平耐藥會(huì)明顯降低一線抗結(jié)核藥品的療效，同時(shí)MTB也會(huì)很快發(fā)展為對(duì)異煙肼耐藥，成為MDR-TB。據(jù)WHO 2019年全球結(jié)核病報(bào)告，2018年全球估計(jì)約有48.4萬例新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病患者，而這些患者中有78%為MDR-TB。在MDR-TB患者中，有6.2%估計(jì)為XDR-TB。有3個(gè)國家占了全球50%的MDR/RR-TB患者，分別為印度(27%)、中國(14%)和俄羅斯(9%)[6]。所以在今后的工作中更應(yīng)該重視利福平耐藥結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷，加大政府投入，規(guī)范、合理臨床用藥，早發(fā)現(xiàn)、早診療，有效阻止MDR/RR-TB的傳播。

本研究結(jié)果顯示，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星的任何耐藥率分別為24.68%、18.18%、5.84%、8.44%，均高于2013年全國耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)核病患者單耐藥譜構(gòu)成比(14.69%、9.55%、3.5%、6.2%)[13]。提示青南地區(qū)MDR/RR-TB疫情較為嚴(yán)重。

本次研究結(jié)果顯示，性別、年齡、民族、職業(yè)等人群特征總耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。耐藥MTB流行因素多而復(fù)雜，居住地為農(nóng)村、文化程度為初中及以下、當(dāng)?shù)蒯t(yī)療水平、患者家庭收入、治療不規(guī)范、年齡、性別等均是MTB產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)因素[15-17]；男性總耐藥率高可能與抽煙、不良生活習(xí)慣等有關(guān)；本次研究顯示中青年組(<45及45～60歲)總耐藥率高，與陳燕梅等[18]的研究結(jié)果相近。原因可能與中青年為家庭中的主要經(jīng)濟(jì)來源，生活、工作壓力大，出入環(huán)境復(fù)雜，生活不規(guī)律造成免疫力下降而成為高危人群。藏族、蒙古族總耐藥率高，一方面是本次樣本收集人群主要以藏族為主，另一方面與該民族長期居住在帳房的生活習(xí)慣相關(guān)，為便于保暖，帳房通風(fēng)較差，造成空氣不能流通，易造成呼吸道疾病的傳播。學(xué)生總耐藥率高，可能與生活環(huán)境及飲食有關(guān)。學(xué)生發(fā)病主要在牧區(qū)，學(xué)校以寄宿制為主，群體較為聚集。另外，青少年處于生長階段，而寄宿制學(xué)校的食堂能否滿足學(xué)生生長所需的營養(yǎng)需進(jìn)一步了解，如此環(huán)境易患結(jié)核病[19]。另外，可能與學(xué)校結(jié)核病防控工作不完善有關(guān)。梁軍和文國穎[20]對(duì)青海農(nóng)牧區(qū)居民的結(jié)核病防治行為傾向調(diào)查顯示: 如果有類似肺結(jié)核的癥狀，約40.00%的人選擇不就醫(yī)，高達(dá)10.00%的人表示不知道如何處理。農(nóng)牧民對(duì)結(jié)核病防治知識(shí)認(rèn)識(shí)不足、就醫(yī)不及時(shí)、患者自行買藥或不按照抗結(jié)核治療規(guī)則服藥，這些因素都極易導(dǎo)致抗結(jié)核治療失敗，并有可能產(chǎn)生耐藥性。由于本次樣本量較小，對(duì)人群特征耐藥類型未作進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究廣泛耐藥率可能比實(shí)際情況略低，因?yàn)槎€抗結(jié)核藥品在本次試驗(yàn)中只選擇Ofx和Km兩種，MDR-TB還可能對(duì)其他未測(cè)二線抗結(jié)核藥品耐藥，而使XDR-TB未檢測(cè)出,造成其比率可能比實(shí)際低。

綜上所述，青海南部地區(qū)MTB對(duì)6種常用抗結(jié)核藥品的耐藥率較高，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中青年、學(xué)校、農(nóng)牧民等重點(diǎn)人群耐藥性監(jiān)測(cè)與治療，強(qiáng)化農(nóng)牧區(qū)工作，進(jìn)一步落實(shí)農(nóng)牧民等重點(diǎn)人群薄弱環(huán)節(jié)的結(jié)核病防治措施[21]，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，減少耐藥的產(chǎn)生。