浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 杭州 310003

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一組以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，發(fā)病率、致殘率均較高[1-2]，隨著患者年齡增加、抵抗力下降，COPD并發(fā)癥增多、死亡風(fēng)險增加，嚴重影響患者生活質(zhì)量，并增加社會經(jīng)濟負擔(dān)。盡管支氣管擴張劑、抗炎藥物能一定程度地改善患者臨床癥狀，但無法完全治愈疾病，目前也尚未找到更為理想的治療手段。COPD的發(fā)生機制未完全清晰，因此研究COPD的分子機制對于探尋新的治療手段，提高臨床療效有著重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，肺血管重構(gòu)是COPD的發(fā)生、發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，而與此相關(guān)的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、兩面神激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）等信號通路也是當(dāng)前的研究熱點[3-5]。保肺定喘湯是由國家級名老中醫(yī)王會仁教授所提出的經(jīng)驗方，治療COPD臨床效果良好[6]。為進一步探索保肺定喘湯治療COPD的相關(guān)機制，本研究以肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle ceu，PASMC）作為研究對象，探討其對PASMC增殖、凋亡以及相關(guān)信號通路的影響，以期幫助臨床認識肺血管重構(gòu)的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠8只購于浙江省實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2008-0033]，6～8周齡，體質(zhì)量170～210g，平均體質(zhì)量（195.00±35.50）g，均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心［實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184］。

1.2 細胞 PASMC購自于美國Cell Signaling Technology公司（批號：13110S）。

1.3 藥品與試劑 保肺定喘湯組成：甘草6g，桔梗、麥冬各9g，當(dāng)歸、仙靈脾各10g，黨參、黃芪、丹參、熟地、廣地龍各15g。以上藥材均購自同仁堂（亳州）飲片公司，在實驗室制成生藥含量3.1g·mL-1的流浸膏，4℃保存?zhèn)溆谩?R4F香煙來自于美國肯塔基大學(xué)；胰酶購于舜冉（上海）生物科技有限公司（批號：25200-056）；高糖完全達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購于上海雅吉生物科技有限公司（批號：PM150210B）；Annexin-V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）液購于上海邦景公司（批號：BJ-15163）；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 單抗、STAT3單抗、兩面神激酶2（Janus kinase 2，JAK2）單抗均購于上海群己生物科技有限公司 （批號：單抗-MAB19093、單抗-MAB19127、單抗-MAB22312）；酪氨酸蛋白激酶抑制劑AG490購于艾美捷科技有限公司（批號：SIH-428-25MG-E）。

1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購于廣州永諾生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 細胞周期檢測 PASMC以含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5% CO2條件下生長，選擇指數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。將SD大鼠隨機分成2組，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，分別予12.4g/（kg·d）保肺定喘湯、等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，2次/d，連續(xù)3d。末次灌胃1h后心臟采血，3 000r/min離心10min，分離血清，過濾、滅活后，分別獲得空白血清和含藥血清，均于-70℃保存?zhèn)溆?。?～10代生長良好的PASMC，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h至細胞處于G0期，分為空白對照組（培養(yǎng)基中加入0.9%氯化鈉溶液）、空白血清組（培養(yǎng)基中加入空白血清）、藥物血清組（培養(yǎng)基中加入10%含藥血清），細胞繼續(xù)培養(yǎng)12h，胰酶處理后棄去上清液，固定、沖洗、孵育，流式細胞儀檢測，488nm波長下檢測細胞周期。

1.5.2 制取香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）液 采用CSE造模，煙霧存于50mL注射器內(nèi)，取10支注入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM高糖培養(yǎng)基25mL的玻璃瓶中，獲得100%CSE原液，取CSE原液10mL加90mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基得10%的CSE液。

1.5.3 給藥 取對數(shù)生長期PASMC，以1×104/孔的細胞數(shù)量接種于96孔板中，并分為對照組（培養(yǎng)基中加入0.9%氯化鈉溶液+空白血清）、模型組（培養(yǎng)基中加入10%CSE+空白血清）、藥物組（培養(yǎng)基中加入10%CSE+10%含藥血清），各組細胞均在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.4 細胞凋亡檢測 對照組、模型組、藥物組培養(yǎng)24h后，收集細胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，離心、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 洗滌后加入2μL Annexin-V+2μLPI行聯(lián)合標(biāo)記，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5.5 Western blot檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達 將細胞分為對照組（培養(yǎng)基中加入0.9%氯化鈉溶液+空白血清）、AG490組（培養(yǎng)基中加入終濃度為30nmol·mL-1的AG490）、模型組 （培養(yǎng)基中加入10%CSE+空白血清）、CSE+AG490組 （培養(yǎng)基中加入10%CSE+終濃度為30nmol·mL-1的AG490）、藥物組（培養(yǎng)基中加入10%CSE+10%含藥血清）。各組培養(yǎng)48h后收集細胞，裂解后離心，取上清液移入離心管，蛋白定量后電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后加入一抗，4℃孵育過夜，Tris-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline Tween，TBST）洗滌后加入二抗，室溫孵育2h，TBST脫色洗膜3次，以化學(xué)成像分析儀掃膜，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值表示蛋白相對表達量，以三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphata dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參。

1.5.6 Western blot檢測JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白的表達 將細胞分為分對照組（培養(yǎng)基中加入0.9%氯化鈉溶液+空白血清）、模型組（培養(yǎng)基中加入10%CSE+空白血清）、藥物組（培養(yǎng)基中加入10%CSE+10%含藥血清），各組培養(yǎng)48h后收集細胞，以Western blot檢測JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白的表達，操作步驟同1.5.5。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用獨立t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PASMC的細胞周期比較 空白對照組、空白血清組及藥物血清組PASMC的細胞周期分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組PASMC凋亡率比較 流式細胞儀檢測提示，模型組和藥物組PASMC凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），藥物組PASMC凋亡率顯著低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組PASMC細胞周期比較（±s，%）Tab.1 Comparison of PASMC cell cycle in each group（±s，%）

表1 各組PASMC細胞周期比較（±s，%）Tab.1 Comparison of PASMC cell cycle in each group（±s，%）

組別 G1期 G2期 S期空白對照組 80.69±1.41 0.00±0.46 19.04±1.58空白血清組 80.38±0.68 0.05±0.11 19.62±0.68藥物血清組 81.77±1.18 0.00±0.00 18.23±1.18 F值 3.325 0.089 2.689 P值 0.056 0.915 0.091

表2 各組PASMC凋亡率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of PASMC in each group（±s，%）

表2 各組PASMC凋亡率比較（±s，%）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of PASMC in each group（±s，%）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05Note:Compared with control group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05

細胞凋亡率對照組 4.38±0.37模型組 20.38±1.35#藥物組 11.10±1.14#*F值 475.332 P值 ＜0.05組別

2.3 各組PCNA表達水平比較 與對照組比較，模型組、藥物組、CSE+AG490組PCNA相對表達量均有所上升，模型組PCNA相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；而CSE+AG490組及藥物組PCNA相對表達量均顯著低于模型組（P＜0.05），CSE+AG490組與藥物組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組PCNA表達比較Fig.1 Comparison of PCNA expression in each group

2.4 各組JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較模型組p-JAK/JAK、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3比值均顯著高于對照組p-JAK/JAK、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3比值（P＜0.05）；藥物組p-JAK/JAK、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3比值均顯著低于模型組（P＜0.05）。見表3、圖2。

3 討論

誘發(fā)COPD的因素眾多，α1-抗胰蛋白酶缺乏、吸煙（最主要的環(huán)境因素）、接觸職業(yè)粉塵、感染等都可引發(fā)該病[7-8]，但臨床上仍有相當(dāng)一部分患者的病因未明，且目前尚不能徹底治愈，因此積極探討有效防治COPD的手段具有重要的臨床意義。肺血管重構(gòu)在COPD的病情進展中處于關(guān)鍵地位[9-11]，也是引發(fā)COPD患者肺源性心臟病的主因，但目前對于肺血管重構(gòu)的具體機制尚未完全清晰。目前認為，肺血管周圍基質(zhì)沉積、平滑肌異常增殖、血管內(nèi)皮受損及炎性浸潤都可刺激肺血管重構(gòu)，且近年來學(xué)者們越來越關(guān)注炎性因子、炎性趨化因子的多信號傳導(dǎo)通路在COPD發(fā)生、發(fā)展進程的作用機制。保肺定喘湯是由國家級名老中醫(yī)王會仁教授所提出的經(jīng)驗方，研究報道其治療COPD臨床效果良好[6]。楊宏寬等[12]研究指出，保肺定喘湯同舒尼替尼一樣有助于抑制肺血管重構(gòu)，但其具體機制未明。

PASMC是肺血管重構(gòu)的主要效應(yīng)細胞之一，因此本研究選擇PASMC作為研究肺血管重構(gòu)相關(guān)分子機制的靶細胞。細胞凋亡也稱為程序性死亡，是細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。研究證實PASMC增殖與凋亡失衡是肺血管重構(gòu)的誘因[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，保肺定喘湯含藥血清能抑制CSE誘導(dǎo)的細胞增殖[13]。本研究結(jié)果提示，與空白血清組比較，藥物血清干預(yù)并不影響PASMC的細胞周期，但藥物組細胞凋亡率明顯低于模型組，以此推測保肺定喘湯會抑制CSE誘導(dǎo)的PASMC凋亡，但該作用與細胞周期阻滯無關(guān)。結(jié)合既往研究結(jié)果，提示保肺定喘湯可能通過調(diào)整CSE誘導(dǎo)的PASMC增殖與凋亡失衡，從而改善肺血管重構(gòu)。

表3 各組PASMC中JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway related proteing in each group（±s）

表3 各組PASMC中JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of JAK/STAT signaling pathway related proteing in each group（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05Note:Compared with control group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05

組別 p-JAK/JAK p-STAT1/STAT1 p-STAT3/STAT3對照組 0.53±0.09 0.49±0.08 0.43±0.07模型組 0.83±0.10# 1.47±0.10# 1.48±0.11#藥物組 0.68±0.08#* 1.13±0.09#* 1.19±0.07#*F值 22.041 242.547 322.228 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖2 各組JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達比較Fig.2 Comparison of JAK/STAT signaling pathway related proteins expression in each group

目前已有較多研究顯示，JAK、STAT磷酸化下調(diào)與PCNA表達以及細胞凋亡密切相關(guān)[14-15]。JAK/STAT信號通路在細胞增殖、凋亡過程中具有重要作用。JAK包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2）共4個非受體蛋白酪氨酸激酶家族成員，廣泛參與多種細胞的增殖分化進程，與消化道腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、免疫功能缺陷等疾病密切相關(guān)[16-17]，白細胞介素、白血病抑制因子等細胞因子均可激活JAK蛋白磷酸化。STAT包括STAT1、STAT2、STAT3等7種成員，作為JAK下游的蛋白，STAT在細胞質(zhì)中以單體形式存在，可將細胞信號傳導(dǎo)至細胞核內(nèi)。JAK激活后可催化受體上的酪氨酸殘基磷酸化，并形成相應(yīng)的STAT結(jié)合位點，STAT與該位點結(jié)合后發(fā)生磷酸化而被激活，活化的STAT進入細胞核內(nèi)與目的基因的啟動子相結(jié)合，從而激活相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進肺血管重構(gòu)[14]。而本研究顯示，與JAK/STAT通路阻斷劑AG490組比較，模型組的PCNA顯著升高，而藥物組的PCNA含量與AG490組相當(dāng)，這提示保肺定喘湯可抑制肺血管重構(gòu)，而且作用與AG490相似。進一步研究顯示，藥物組的p-JAK/JAK、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3均顯著低于模型組，筆者推測保肺定喘湯抑制肺血管重構(gòu)的機制可能與下調(diào)JAK、STAT1、STAT3的磷酸化有關(guān)，該結(jié)果與何飛等[18]既往研究發(fā)現(xiàn)保肺定喘湯能夠抑制p-JAK2、p-STAT3表達，并抑制IL-6的分泌一致。本研究中藥物組的p-STAT1/STAT1低于模型組，而且其細胞凋亡率也低于模型組，提示保肺定喘湯還可作用于STAT1的表達從而影響細胞凋亡。

綜上所述，保肺定喘湯通過干預(yù)COPD的JAK/STAT信號通路而抑制肺血管重構(gòu)，其作用機制可能與抑制JKA、STAT1、STAT3等磷酸化有關(guān)。本試驗嘗試闡述保肺定喘湯對肺血管重構(gòu)的JAK/STAT通路的影響，但COPD分子機制復(fù)雜，且本研究未設(shè)立STAT的特異性阻斷劑組，仍有待于后續(xù)更為嚴謹?shù)亩嘀行难芯可钊胩接憽?/p>