汪運(yùn)超， 李子青， 向 勤， 譚擁軍

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院 湖南省抗癌靶向蛋白藥物工程研究中心，長沙410082)

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1 (Forkhead box M1,FOXM1) 屬于Forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族，是一種促癌轉(zhuǎn)錄因子[1]。FOXM1主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育、組織再生的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的功能[2-3]。近年越來越多的研究表明，F(xiàn)OXM1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有著重要的功能，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)、促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)增加腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性、促進(jìn)腫瘤誘導(dǎo)的血管生長、通過擴(kuò)增腫瘤相關(guān)的干細(xì)胞或起始細(xì)胞促使腫瘤發(fā)生等[4]。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種人類癌細(xì)胞中過表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)較低甚至不表達(dá)。其中FOXM1高表達(dá)的乳腺癌往往呈低分化、高度惡性、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，且與多種致瘤信號(hào)途徑相關(guān)，臨床預(yù)后不佳[5]。但是FOXM1如何調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。因此，能夠?yàn)檠芯縁OXM1在乳腺癌發(fā)展中的分子機(jī)制提供方便有效的細(xì)胞模型工具，對了解乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、確定治療腫瘤靶點(diǎn)均具有重大意義。

慢病毒載體是近年來才發(fā)展的一種基因治療載體，可在體內(nèi)較長期的表達(dá)[6]。目前來說，綠色熒光蛋白 (Green fluorecent protein, GFP) 是最佳標(biāo)記分子，具有檢測簡單、熒光特異性強(qiáng)等優(yōu)勢[7]，已大范圍應(yīng)用于體外及活體研究。文中所用的啟動(dòng)子示蹤體系具有在細(xì)胞內(nèi)能利用慢病毒能夠?qū)⒆陨鞤NA與宿主染色體整合的優(yōu)點(diǎn)[8]，將某基因的啟動(dòng)子序列與慢病毒自身攜帶的啟動(dòng)序列相互替換，結(jié)合報(bào)告基因標(biāo)記。此方法已經(jīng)成功地用于人腫瘤干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分離[9]。Shan等[10]利用Nanog基因啟動(dòng)子結(jié)合報(bào)告系統(tǒng)從肝癌細(xì)胞中分離并獲得了Nanog-和Nanog+細(xì)胞亞群。本研究采取了類似的策略，構(gòu)建了一個(gè)用FOXM1啟動(dòng)子介導(dǎo)GFP熒光蛋白表達(dá)的慢病毒體系，通過這種體系可以用外源性GFP蛋白表達(dá)來追蹤內(nèi)源性FOXM1的表達(dá)，并利用GFP蛋白綠色熒光信號(hào)對FOXM1表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行示蹤，旨在為FOXM1作為靶向治療提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

在 EPD數(shù)據(jù)庫中查找 Promoter-FOXM1序列，并在其5′端和3′端分別加入XholI及XbalI限制性核酸內(nèi)酶切位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)引物，具體序列如下：正義鏈5′-GCGCCTCGAGCATTTGTTTGTTTTGGAGAC-3′；反義鏈 5′-GCGCTCTAGACGTTAGGCCGTAGCTCCG-3′；引物由上海生工有限公司合成。首先在PCR儀上進(jìn)行變性、退火、延伸，再利用限制性核酸內(nèi)切酶XholI和XbalI雙酶切pLvx-ef1α-GFP載體過夜。使用T4 DNA連接酶對PCR產(chǎn)物與雙酶切后的載體在4 ℃下連接過夜，DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，冰上30 min后在42 ℃下熱擊90 s，迅速放置于冰上2 min，加1 mL不含抗生素的液體培養(yǎng)基，搖床37 ℃下，擴(kuò)大培養(yǎng)45 min， 取適量已轉(zhuǎn)化成功的感受態(tài)均勻涂在具有抗性的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。最后挑取單克隆菌落，經(jīng)雙酶切電泳鑒定陽性克隆后，將其鑒定的質(zhì)粒在生工公司完成測序。將測序正確的菌液加甘油保存，進(jìn)行質(zhì)粒大提后用于后續(xù)病毒包裝的流程。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人的腎上皮細(xì)胞HEK-293T培養(yǎng)于10%胎牛血清的 DMEM(加青鏈霉素)中，在溫度為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，等細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代。本實(shí)驗(yàn)所用的均為狀態(tài)良好且在生長對數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 慢病毒Lv-PromoterFOXM1-GFP的包裝與慢病毒感染

慢病毒包裝所用到的細(xì)胞是HEK-293T，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，取已構(gòu)建的FOXM1啟動(dòng)子攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒重組質(zhì)粒Lv-PromoterFOXM1-GFP，包裝質(zhì)粒Δ8.91和PVSVG，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)后的48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)來收集上層培養(yǎng)液，離心5 min后取上清液并用0.45 μm的過濾頭過濾掉雜質(zhì)，即為可用的病毒。取適量病毒上清液加入細(xì)胞密度為70%～80%的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，并向培養(yǎng)基中加入相應(yīng)比例的聚凝胺(polybrene)，目的是增加感染效率，感染72 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光情況。

1.4 流式細(xì)胞儀分選FOXM1高表達(dá)細(xì)胞和FOXM1低表達(dá)細(xì)胞

流式細(xì)胞分選約1×107已感染成功的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化，4 ℃離心，1000 r/min，5 min，去掉上清液，再加PBS清洗2～3次，用不含血清和雙抗的DMEM均勻吹打細(xì)胞，使其成單細(xì)胞懸液，置于冰上并避光，等待上機(jī)進(jìn)行檢測分選。流式分選通過貝克曼流式分選儀(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院)來分選。所分選出的細(xì)胞用加20%血清和雙倍雙抗的DMEM接收，收集后立即培養(yǎng)于正常的培養(yǎng)環(huán)境中。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出FOXM1高表達(dá)細(xì)胞和FOXM1低表達(dá)細(xì)胞后，收集細(xì)胞并提取總蛋白，將處理好的樣品以每孔80 μg的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。5%脫脂牛奶浸泡封閉2～3 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌30 min后再加對應(yīng)的二抗室溫2～3 h，最后進(jìn)行顯影并拍照保存。β-actin作為內(nèi)參驗(yàn)證蛋白的含量。

1.6 熒光定量PCR

Omega RNA提取試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟參照相應(yīng)試劑盒的說明書，流式細(xì)胞儀分選出的FOXM1 高表達(dá)細(xì)胞和FOXM1低表達(dá)細(xì)胞，分別提取兩個(gè)細(xì)胞群體的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher) 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR GreenMaster Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-RCR測定，94 ℃預(yù)變性 3 min，之后40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)如下：94 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lv-PromoterFOXM1-GFP慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定

在EPD數(shù)據(jù)庫中查找Promoter-FOXM1序列，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)并合成Promoter-FOXM1引物，在慢病毒載體pLvx-ef1α-GFP多克隆位點(diǎn)處選擇XholⅠ和XbalⅠ進(jìn)行雙酶切后，將PCR擴(kuò)增的Promoter-FOXM1序列，經(jīng)T4DNA連接酶連到pLvx-ef1α-GFP載體中，轉(zhuǎn)化、涂板，挑單克隆菌落，選取了5個(gè)單菌落，在1%的瓊脂糖凝膠下電泳檢測。結(jié)果(圖1)表明，除5號(hào)轉(zhuǎn)化子以外，其余長度大小均為1200 bp，從中挑取兩個(gè)單克隆菌送上海生工進(jìn)行測序，經(jīng)對比測序，結(jié)果顯示目的基因已成功連接至慢病毒載體中。

表1 相關(guān)基因的qRT-PCR引物

1：1 kb DNA Ladder Marker；2～6：Lv-PromoterFOXM1-GFP轉(zhuǎn)化子

2.2 慢病毒的包裝及其滴度測定

在慢病毒包裝之前，首先查看293T細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。選取生長密度為70%～80%的293T細(xì)胞，將慢病毒重組質(zhì)粒Lv-PromoterFOXM1-GFP，包裝質(zhì)粒Δ8.91和PVSVG共同轉(zhuǎn)293T細(xì)胞48 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察。結(jié)果[圖2(a)和(b)]發(fā)現(xiàn)有綠色熒光，表明重組質(zhì)粒正確并表達(dá)正常。將上述收集的慢病毒上清離心后并用0.45 μm的無菌過濾頭進(jìn)行過濾，除去雜質(zhì)，得到的慢病毒用慢病毒滴度快速檢測卡快速檢測，和比色進(jìn)行對比，比色卡見圖2(c)，比色卡有T1、T2、T3、T4和T5共5個(gè)范圍值。在正常情況下，每100 000慢病毒顆粒(LPs)中會(huì)有1個(gè)具有感染活性的病毒載體，即1TU。通常上清中病毒含量需要超過106TU/mL，即在T1～T3范圍值內(nèi)，才能確保得到足夠濃度的慢病毒載體。通過與比色卡對比，檢測卡結(jié)果顯示病毒滴度大概是1.25×106～7TU/ mL，在T1～T2的范圍值內(nèi)，說明包裝所得到的慢病毒濃度足夠進(jìn)行下一步感染目的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.3 慢病毒成功感染人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231

MDA-MB-231細(xì)胞被慢病毒上清感染24 h后，用加10%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及綠色熒光的表達(dá)情況。在隨機(jī)挑選的每個(gè)視野下均可見綠色熒光 GFP 的表達(dá)[圖3(a)和(b)]。由于GFP 是由FOXM1作為啟動(dòng)子來啟動(dòng)表達(dá)的，這些有GFP表達(dá)的細(xì)胞即為FOXM1高表達(dá)細(xì)胞。結(jié)果表明病毒Lv-PromoterFOXM1-GFP成功感染上了MDA-MB-231。

(a)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染白光視野；(b)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光視野(倒置熒光顯微鏡×200)；(c)慢病毒滴度快速檢測卡

2.4 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中FOXM1高表達(dá)與低表達(dá)細(xì)胞亞群分離

用沒有感染病毒的MDA-MB-231單細(xì)胞樣品作為陰性對照，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析檢測GFP的陽性率約為58%[圖4(a)]，說明在MDA-MB-231中高表達(dá)FOXM1的細(xì)胞比例占半數(shù)。然后以未感染病毒的MDA-MB-231單細(xì)胞樣品作為陰性對照，根據(jù)GFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分選出顯著的FOXM1低表達(dá)(231 M1 Low)和FOXM1高表達(dá)(231 M1 High)，具體見圖4(b)。

(a)白光視野； (b)GFP熒光視野。倒置熒光顯微鏡×200

(a)以MDA-MB-231未感染的細(xì)胞作為陰性對照，流式細(xì)胞分析GFP陽性細(xì)胞所占比例；(b)流式細(xì)胞儀分選FOXM1低表達(dá)和FOXM1高表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞群分別所占的比例

2.5 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中FOXM1高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞亞群的鑒定

以未感染病毒的MDA-MB-231單細(xì)胞樣品為對照，根據(jù)GFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分選出顯著的FOXM1低表達(dá)(231 M1 Low)和FOXM1高表達(dá)的細(xì)胞(231 M1 High)，分選后貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞正常增殖后，分別提取兩個(gè)亞群細(xì)胞的總蛋白，Western Blot結(jié)果說明，根據(jù)GFP所分選出的細(xì)胞能很好地對應(yīng)FOXM1的表達(dá)量[圖5(a)]。分別提總RNA，后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR結(jié)果顯示，GFP表達(dá)量能很好地對應(yīng)FOXM1表達(dá)量[圖5(b)]。

(a)qRT-PCR分別檢測兩個(gè)細(xì)胞亞群的FOXM1和GFP的表達(dá)；(b)Western Blot 分別檢測兩個(gè)細(xì)胞亞群的FOXM1和GFP的表達(dá)

3 討論

乳腺癌在女性惡性腫瘤中十分常見，且對女性身心健康造成嚴(yán)重的威脅[11]。在過去的幾十年中，盡管乳腺癌的診斷和治療水平均有較大改善，但腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是威脅患者生命的重要因素[12]。因此，迫切需要找到特異性的腫瘤分子標(biāo)記物和其調(diào)控機(jī)制為腫瘤治療提供新方式。

FOXM1是一類與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、衰老、再生、DNA損傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等許多病理生理過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[13]。目前在多種類型的腫瘤細(xì)胞中檢測到過表達(dá)的FOXM1。研究表明，F(xiàn)OXM1的表達(dá)水平增高不僅是乳腺癌發(fā)生的早期事件，而且與乳腺癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后等因素均有直接關(guān)系[14-15]。此外，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中抑制FOXM1的表達(dá)，可引起腫瘤細(xì)胞的死亡及永久性的細(xì)胞周期滯留，在不損傷正常組織的情況下，抑制FOXM1的表達(dá)可阻止腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療腫瘤的效果[16]。因此，F(xiàn)OXM1在細(xì)胞中的特殊功能以及與乳腺癌之間的密切關(guān)系，已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索FOXM1的更多生物學(xué)功能和腫瘤治療的分子機(jī)制，為腫瘤治療開辟新思路。

目前，在基因治療方面，慢病毒的應(yīng)用比較廣泛，對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染有多種方法，但是細(xì)胞種類不同，其轉(zhuǎn)染效率也會(huì)有所差異，其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染最為常見[17]，但脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成本較高。所以，為了達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效果，選擇低毒且高效的載體是很重要的[18]。本研究所用到的慢病毒載體，其來源是I型的HIV病毒，可利用整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，將自身的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 DNA 并可整合至宿主細(xì)胞的染色體中，可使目的基因能夠在宿主的細(xì)胞中穩(wěn)定且長期表達(dá)，且感染能力強(qiáng)、毒性小，因此被認(rèn)定是將外源的基因整合至細(xì)胞內(nèi)最有效的載體[19-21]。慢病毒啟動(dòng)子示蹤體系在細(xì)胞內(nèi)能利用慢病毒將自身DNA與宿主染色體整合的優(yōu)點(diǎn)，將某個(gè)基因的啟動(dòng)子序列與慢病毒自身攜帶的啟動(dòng)序列替換[8]。正是基于這些理論基礎(chǔ)，本研究構(gòu)建了以FOXM1為啟動(dòng)子且攜帶有綠色熒光蛋白GFP慢病毒表達(dá)載體Lv-pFOXM1-GFP，將FOXM1基因的啟動(dòng)子與熒光蛋白GFP相連，由于基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)或喪失能夠引起熒光信號(hào)的變化，進(jìn)而根據(jù)熒光判斷出人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中FOXM1的表達(dá)情況。再通過流式細(xì)胞儀從MDA-MB-231細(xì)胞中分離出FOXM1高表達(dá)細(xì)胞及FOXM1低表達(dá)細(xì)胞兩個(gè)細(xì)胞亞群。

綜上所述，通過構(gòu)建FOXM1基因啟動(dòng)子攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒載體，從熒光的變化可視化地反映了細(xì)胞內(nèi)FOXM1的變化過程，從而達(dá)到體外示蹤的目的。后續(xù)可用FOXM1不同的細(xì)胞亞群進(jìn)行小鼠的活體實(shí)驗(yàn)研究，通過熒光的變化可直觀地觀察小鼠活體中乳腺癌的生長及轉(zhuǎn)移情況，為研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具材料，并且對研究發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)、尋找特異性靶向治療方法及判斷患者的預(yù)后等均具有重要意義。