張一帆 黃龍花 楊穎茵 何嘉豪 余 歡 陳少丹 謝意珍 楊小兵*

（1廣東省微生物研究所 廣東省科學院/華南應用微生物國家重點實驗室/廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東廣州510000；2 西藏康寶生物科技有限公司，西藏林芝850400；3廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州510000）

中國被毛孢（Hirsutella sinensis）現(xiàn)已被證明是冬蟲夏草的無性型[1-3]，然而是否是唯一的無性型，目前尚無定論[4-7]。中國被毛孢可在培養(yǎng)基上生長并獲得一定量的菌絲體[8-10]，但尚未有報道發(fā)現(xiàn)中國被毛孢培養(yǎng)物能直接在一定培養(yǎng)條件下形成肉眼可見的子座。中華被毛孢菌絲體及其分生孢子均可侵染宿主蟲體[11-12]，當形成僵蟲后，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下可形成子實體[13]。

中國被毛孢與冬蟲夏草有相似的內(nèi)含物[14-15]，但未見系統(tǒng)性研究，例如在建立冬蟲夏草代謝物庫的基礎(chǔ)上，對同一來源兩者的代謝物組進行比較，甚至對同一子實體上分離得到的中國被毛孢與其子實體的代謝物組進行比較等。有報道指出中國被毛孢的甘露醇、甾醇不如冬蟲夏草含量高[16-17]，也有報道指出，在一些脂類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)方面優(yōu)于冬蟲夏草[18]。在利用宿主蟲體的半人工培養(yǎng)條件下，冬蟲夏草子實體形成率仍相當?shù)停◤某晒η秩鞠x體到長出子實體少于千分之一）[19]。而中國被毛孢的菌絲體生物量卻可通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，較便捷、較大量獲得[9，20]。這使得中國被毛孢被認為是冬蟲夏草子實體的一個較為理想的候選替代品。

不同來源的中國被毛孢有不同研究報道[21-23]。例如，一株來自西藏那曲市的中國被毛孢的多糖組分可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，顯著降低高脂喂食后小鼠的體重增加量，以及減少代謝紊亂[24]；在培養(yǎng)基中添加一定量的錳離子，可使一株來自于青海省的中國被毛孢的多糖產(chǎn)量顯著提高[25]；來自西藏、青海、云南、四川的四株中國被毛孢的分生孢子大小相互間有顯著差異[26]；在同一個產(chǎn)地中，不同個體分離得到的中國被毛孢，在相同培養(yǎng)條件下，其分生孢子數(shù)量相互間有顯著差異[27]。而不同來源中國被毛孢代謝物的相互比較尚未見報道。

因此，筆者對多個中國被毛孢菌株進行ITS 序列分析與鑒定，并選取其中三個不同來源的中華被毛孢菌株，對其生長特性進行了初步研究，并通過不同培養(yǎng)方法和提取方法，比較三個菌株中小分子代謝物整體組成的差異。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

選用廣東省微生物研究所食用菌研究與發(fā)展中心分離和保藏的菌株，代號 Z2、Z3、Z3-la、Z4、I15、XG、P1（其中Z 開頭菌株分離材料來自西藏工布江達縣，I15 來自那曲市，XG 來自云南香格里拉市，P1 為引進的蝙蝠蛾擬青霉）。另從中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）購得中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉各一株作為鑒定時參照菌株，菌株代號重新定為Z-YW和Ph-YW。

1.2 培養(yǎng)基配方

平板培養(yǎng)基配方為：蠶蛹15.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉10.0 g，葡萄糖15.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鋅0.3 g，硫酸錳0.3 g，維生素B60.05 g，瓊脂粉20.0 g，純凈水補足至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH。液體培養(yǎng)基配方與固體培養(yǎng)基配方相同，配制時先將蠶蛹進行100 ℃水浴1 h，然后濾去蠶蛹顆粒，濾液混合其他成分。

1.3 菌種鑒定

取平板培養(yǎng)基菌絲體，使用試劑盒（Magen，Hi?Pure Fungal DNA Mini Kit II）提取總 DNA 模板，與ITS 通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行 PCR，回收目的條帶，送樣華大基因測序，獲得各樣品ITS序列。

1.4 菌絲生長速度測定

將供試三個不同來源的菌株（Z4，XG，I15）接種平板培養(yǎng)基上，18 ℃避光培養(yǎng)，待菌落初步形成后，以劃線法進行菌絲生長速度測定，每7 d 記錄一次生長情況（菌落前端位置）。記錄5 次生長區(qū)間，完成后用毫米直尺量取生長區(qū)間，取均值即為該菌株菌絲的生長速度。

1.5 質(zhì)譜檢測

1.5.1 質(zhì)譜分析前樣品制備

分別取相應菌株接種在平板培養(yǎng)基上和液體培養(yǎng)基中，18 ℃避光培養(yǎng)60 d，液體搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速120 r/min（哈東聯(lián)DLHR Q200）。提取平板培養(yǎng)基上的菌絲體時，用鑷子掀起培養(yǎng)基表面菌落，用移液器槍頭刮去菌落背面的培養(yǎng)基，并用二級水漂洗去除殘余固體培養(yǎng)基；提取液體培養(yǎng)基中的菌絲體時，用200 目濾網(wǎng)墊于布氏漏斗中，接抽濾裝置，收集菌絲球并去除培養(yǎng)殘液，并用二級水漂洗菌絲球至濾出液無明顯顏色為止。所得的兩種菌絲體凍干并粉碎，每種菌絲體樣品再分別用超純水、乙酸乙酯按0.90 g 樣品、2.0 mL 溶劑進行超聲提?。ǔ暡ㄇ逑磧x，AUTO SCIENCE AS10200BDT），工作頻率40 kHz、功率300 W、水浴溫度40 ℃、處理時間60 min。水提樣品在提取后離心除盡樣品殘渣，上清液過水相濾膜（0.22 μm）后待上機；乙酸乙酯樣品在提取后離心除盡樣品殘渣，上清液在室溫下?lián)]發(fā)至剩下少量黏稠狀殘余物，并且不再有乙酸乙酯氣味，然后用2.0 mL 甲醇復溶黏稠狀殘余物，復溶后的溶液過有機相濾膜后（0.22 μm）待上機。

1.5.2 色譜與質(zhì)譜條件

所用儀器為超高效液相——高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLC-HRMS，儀器型號為Thermo Q Exacutive Focus）。色譜條件為：Thermo Hypersil GOLD? C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm），流動相（A）0.1%甲酸水溶液，（B）乙腈，梯度洗脫（0～12 min，10%～95%B；12～16 min，95%B），柱 溫 25 ℃ ，流 速0.30 mL/min，進樣量2 μL。質(zhì)譜條件為：加熱電噴霧離子源，鞘氣流速45 單位，輔助氣流速8 單位，噴霧電壓3.00 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣流加熱溫度350 ℃，S-Lens RF 水平50%。數(shù)據(jù)采集模式為一級全掃描（正負模式切換掃描）。一級質(zhì)譜條件：掃描70～1000.0 m/z，分辨率35 000，自動增益控制1e6，最大注入時間50 ms。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 聚類分析

ITS 序列輸入軟件ClustalX 中進行多重比對，再把數(shù)據(jù)文件導入軟件MEGA 中，聚類法采用Neigh?bor-joining 法，Bootstraping 為 1000 次，模型為 p-dis?tance，構(gòu)建聚類樹。

1.6.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

樣品原始數(shù)據(jù)文檔導入軟件工具MSConvert GUI，使用Peak Picking 對原始數(shù)據(jù)進行過濾，并轉(zhuǎn)換文件格式為mzML。轉(zhuǎn)換格式后的文件導入軟件工具MZmine 中，按順序進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測（Mass Detection）、譜峰構(gòu)建（ADAP Chromatogram Builder）、譜峰反卷積（Chromatogram Deconvolution）、同位素峰歸組（Isotopic Grouper）、譜峰比對（RANSAC Aligner）、比對表行信號過濾（Feature List Rows Filter）、比對表補缺（Gap Filling）后，獲得比對文件。將比對文件峰面積數(shù)據(jù)導入軟件工具SIMCA，設(shè)置保留時間為主要分類項（Primary ID），對各樣品數(shù)據(jù)進行建模打分，獲得主成分分析（PAC）結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株聚類分析與鑒定

基于ITS的聚類分析顯示，中國被毛孢（H.sinensis）與蝙蝠蛾擬青霉（P.hepiali）所在分支分屬兩個不同簇。試驗菌株Z2、Z3-1a、Z4、XG、I15、Z-YW與中國被毛孢、冬蟲夏草歸為一族，可基本判定屬于同一個種；試驗菌株P(guān)-YW、P1在聚類分析中與蝙蝠蛾擬青霉歸為一簇，但P1 與蝙蝠蛾擬青霉同簇的Bootstrap支持率較低，經(jīng)BLAST 分析，其序列與多孔木霉無性型（Tolypocladium inflatum，MK020177.1）相 似 度 為100%。Z3 與Z3-la 原是同一條冬蟲夏草上分別從子座和蟲體上分離得到的培養(yǎng)物，兩者菌落外觀相似，但經(jīng)多次重復，其基于ITS 序列的聚類分析結(jié)果始終不與中國被毛孢歸為一簇，而更偏向于蝙蝠蛾擬青霉。推測原因可能是，冬蟲夏草是多種微生物共生體系，傳統(tǒng)的菌種分類手段可能會因分離部位、培養(yǎng)基等原因而富集到某一個物種。

圖1 供試菌株基于ITS的聚類分析

圖2 三種不同來源中國被毛孢菌落形態(tài)（標尺5 mm）

如圖2 所示，三種不同來源的中國被毛孢菌株菌落外觀差別明顯。來源于工布江達縣的菌株Z4菌落灰白色（近似色號1631，2.5B 9/1，CBCC 中國建筑色卡，下同）、圓形、邊緣整齊、臍突狀隆起、表面放射狀皺褶；來源于香格里拉市的菌株XG 菌落顏色偏黃（近似色號0022，8.1Y 9/2）、圓形、邊緣整齊、扁平無隆起（接種點膨大除外）、表面密集發(fā)射狀皺褶；而來源于那曲市的菌株I15 菌落顏色黃白（近似色號1305，2.5Y 9/1）、圓形、邊緣整齊、凸透鏡狀隆起、表面無皺褶。

2.2 pH對中國被毛孢菌絲體生長速度的影響

隨著培養(yǎng)基 pH 的升高（5.5～7.0），不同來源的中國被毛孢菌株菌絲體生長速度呈現(xiàn)不同的變化，如圖3 所示。Z4 在較低的pH5.5 時菌絲生長較快，隨著pH的升高，生長速度降低；I15則相反，隨著培養(yǎng)基pH 升高，菌絲生長速度加快（0.15～0.20 mm/d）；XG 在試驗pH 范圍內(nèi)菌絲生長速度變化不明顯。

圖3 中國被毛孢菌株菌絲體在不同pH平板培養(yǎng)基上的菌絲生長速度

2.3 代謝物組成差異分析

三個不同來源的中國被毛孢菌株，分別通過液體和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌絲球和菌落兩種材料，每種材料再分別使用水、乙酸乙酯進行提取，共獲得12 種提取物。各種提取物經(jīng)LC-MS 分析后，如圖4 建立PCA 模型。圖4 中兩主成分累計解釋率達65.4%（橫軸解釋率大于縱軸）。12種提取物的數(shù)據(jù)點，只要是提取溶劑（水或乙酸乙酯）以及材料獲得方式（液體或平板培養(yǎng)）都相同，則相對聚攏在一起，使整體數(shù)據(jù)較明顯地分為四組（圖4中坐標軸四個象限內(nèi)），每一組中都存在三個不同菌株的提取物數(shù)據(jù)點。另外，比較四個分組中樣品數(shù)據(jù)點的靠近程度發(fā)現(xiàn)，平板培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的提取物數(shù)據(jù)點（AQS、EAS）比液體培養(yǎng)所得的（AQL、EAL）分散程度高。

圖4 中國被毛孢菌絲體代謝物的PAC得分分布圖

3 小結(jié)與討論

三個不同來源中國被毛孢菌株菌落外觀形態(tài)存在明顯差異（圖2），但從ITS聚類分析結(jié)果來看，三者與已入庫的中國被毛孢聚類分組較為接近（圖1），說明三者都是中國被毛孢。何蘇琴等曾對多個分離于甘肅的冬蟲夏草中國被毛孢菌株進行培養(yǎng)，結(jié)果顯示部分菌株在相同培養(yǎng)基上生長時，菌落外觀也存在一定差別[28]。另外，觀察發(fā)現(xiàn)三個菌株經(jīng)多次傳代，在平板培養(yǎng)基上仍展現(xiàn)出各自菌落相對穩(wěn)定的特征。造成這種現(xiàn)象的原因可能是三者相互處于更次一級的分類學單位，或是基于ITS 的聚類分析精度未足夠，又或是三者存在尚未研究清楚的表觀遺傳情況。

中國被毛孢菌株的不同來源也影響了他們各自對培養(yǎng)基pH 的響應。試驗三個不同來源的中國被毛孢菌株的菌絲生長速度，在相同的培養(yǎng)基pH變化內(nèi)呈現(xiàn)出三種不同的變化模式。不少文獻發(fā)現(xiàn)中國被毛孢培養(yǎng)基的最適pH 為6.5[8-9，29]，但同時也有研究通過單因素試驗或正交試驗等得出比6.5更低的最適pH[30-31]。另外，在王錦鋒等的研究中，多個中華被毛孢菌株在同一種培養(yǎng)基上菌絲生長速度差異顯著[32]。這提示在進行中華被毛孢的優(yōu)選培養(yǎng)試驗，尤其是深層發(fā)酵時，需根據(jù)所選菌株選擇其最適pH培養(yǎng)基。

通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，同一菌株使用同一種提取溶劑提取時，其代謝物整體組成因培養(yǎng)基固液狀態(tài)存在明顯差異。YU 等在研究中國被毛孢揮發(fā)性成分以及李淑林在分析中國被毛孢的代謝組學時，也發(fā)現(xiàn)存在這種差異[33-34]。由此可見，培養(yǎng)基固液狀態(tài)對某些目標代謝產(chǎn)物可能有重要影響。另一方面，由于主成分分析中橫軸的解釋率約是縱軸2.5倍，而且四個分組數(shù)據(jù)點在橫軸的距離更大，推測提取液差異對代謝物組成差異的貢獻要大于材料來源方式，這也比較符合用乙酸乙酯提取樣品小極性代謝物，而用水提取中大極性代謝物的特性。再者，使用兩種溶劑提取時，都發(fā)現(xiàn)平板培養(yǎng)三個菌株所得數(shù)據(jù)點分散程度比液體培養(yǎng)的高，推測在比較不同菌株代謝物時，采用固體培養(yǎng)方式可能會發(fā)現(xiàn)更多或更明顯的成分差異。