黃 東 馬成瑤 張彥龍 *

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080）

黑木耳不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有眾多的生物活性[1-2]。黑龍江省獨(dú)特的地理位置和適宜的氣候環(huán)境為黑木耳營(yíng)養(yǎng)成分的積累提供了得天獨(dú)厚的條件，為黑木耳的開(kāi)發(fā)和推廣奠定基礎(chǔ)[3]。黑木耳中活性成分凝集素是一類(lèi)非免疫起源的異源蛋白質(zhì)，可以與細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)中的糖蛋白相互作用，但不改變?nèi)魏喂J(rèn)的共價(jià)結(jié)構(gòu)[4]。凝集素在分化、細(xì)胞-細(xì)胞與宿主-病原體相互作用、細(xì)胞信號(hào)、血清糖蛋白周轉(zhuǎn)、組織轉(zhuǎn)移、先天免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。

NO 的釋放是巨噬細(xì)胞的非特異性免疫的一種重要的機(jī)體防御過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)受到如腫瘤細(xì)胞、病原體及微生物等刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞被活化并產(chǎn)生一系列的效應(yīng)分子，NO便是其中之一[7]。一方面，NO 被作為巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞的重要信使分子，通過(guò)細(xì)胞間信息交換載體功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8]；另一方面，NO對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞與微生物等具有細(xì)胞毒性。iNOS是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，催化L-精氨酸生成NO[9-10]，是哺乳動(dòng)物體NO合成的唯一途徑。NF-κB 是iNOS 基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的調(diào)控因子，NF-κB 由 p65 和 p50 二聚體組成，如果與IκB 結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中則是無(wú)活性的[11]。當(dāng)受到調(diào)控時(shí)可導(dǎo)致NF-κB解離和易位至細(xì)胞核以及誘導(dǎo)促炎癥因子基因的表達(dá)，如IL-1β、IL-6、TNF-α 和iNOS，從而促進(jìn)NO的釋放，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[12-13]。

Typhoniumgiganteum 凝集素（TGL）可以通過(guò)ROS 和NF-κB 細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性因子（TNF-α、IL-1β）的產(chǎn)生且呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴(lài)性[14]。半夏凝集素（PTL）可以通過(guò)ROS和NF-κB細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生[15]。黃精凝集素（PCL）可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）成員ERK、JNK 和p38，以及NF-κB 信號(hào)通路，因此PCL 可以作為一種潛在的靶向凋亡和自噬通路的抗腫瘤藥物[16]。凡納濱蝦C 型凝集素（LvCTL4）可以通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路參與抗菌免疫應(yīng)答[17]。家蠅凝集素（MPL）通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與抗病毒[18]。筆者通過(guò)研究黑木耳中凝集素是否以不依賴(lài)LPS 的形式通過(guò)NF-κB通路促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌以及NO 的分泌，為實(shí)現(xiàn)黑木耳的藥用價(jià)值提供參考，并為后續(xù)黑木耳其他成分的活性研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為東北黑木耳的深加工提供方向和依據(jù)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)東北黑木耳提供更廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞，委托哈爾濱海基生物公司購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；黑木耳凝集素LAA，黑龍江大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室前期純化得到；RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone；胎牛血清，美國(guó)Gibco；iNOS 抗體、NF-κB p50 抗體、NF-κB p65 抗體，上海生工生物工程股份有限公司；全蛋白抽提試劑盒，南京凱基生物科技有限公司；PDTC 抑制劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS 緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

DYY-7C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；Chemi?Doc XRS 凝膠成像儀，美國(guó) Bio-Rad；ELITE 蛋白印跡儀，威泰克有限公司；Biofuge 22R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó) Beckman 公司；Milli-Q 純水器，美國(guó) Milli?pore 公司；BCM-1000 型生物凈化工作臺(tái)，蘇州江東精密儀器有限公司；MLS-3750 高壓蒸氣滅菌器滅菌鍋，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳凝集素的提取

（1）采摘后的新鮮黑木耳用蒸餾水洗凈，分裝成小袋，分別放置在-20 ℃保存，避免黑木耳反復(fù)凍融，破壞蛋白質(zhì)[19]。

（2）選取優(yōu)質(zhì)新鮮黑木耳用蒸餾水洗凈，凍干并用粉碎機(jī)粉碎。稱(chēng)取適量?jī)龈珊谀径郏肞BS將其浸泡過(guò)夜。第二天將浸泡液3 000 r/min 離心30 min，上清液4 ℃保存。向黑木耳上清液緩慢加入20%～80%不同飽和度硫酸銨，4 ℃沉淀過(guò)夜，8 000 r/min 離心25 min，收集沉淀。將收集回來(lái)的沉淀用少量PBS緩沖液溶解后，4 ℃透析2 d，冷凍干燥，即得黑木耳凝集素粗品。

（3）用PBS溶解黑木耳凝集素粗品并過(guò)濾后，與等體積的豬胃粘蛋白II型-溴化氰活化的瓊脂糖4B（PSM-Sepharose）充分混合，4 ℃ 攪拌過(guò)夜[20]。次日，裝到層析柱內(nèi)，用PBS 以1 mL/min 的流速洗掉雜蛋白，當(dāng)基線(xiàn)穩(wěn)定后，再用pH 3.0 甘氨酸溶液以1 mL/min 的速度洗脫，并收集洗脫液。將洗脫液透析除鹽后冷凍凍干，即得到黑木耳凝集素，并命名為L(zhǎng)AA，采用SDS-PAGE檢測(cè)LAA的純度。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)抗炎因子量

PDTC 是NF-κB 常用抑制劑。試驗(yàn)采用不同濃度的PDTC 處理RAW264.7細(xì)胞，用PBS 緩沖液清洗PDTC后，再用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA處理。共設(shè)5個(gè)處理，處理1（對(duì)照）：未添加PDTC和LAA，處理2：僅添加10 μg/mL的LAA，處理3：添加5 μmol/LPDTC+LAA，處理4：添加 10 μmol/L PDTC+LAA，處理 5：添加 20 μmol/L PDTC+LAA。用 ELISA 試劑盒檢測(cè)黑木耳凝集素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的影響。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.3 Griess法檢測(cè)NO分泌量

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理同1.3.2。用Griess法檢測(cè)黑木耳凝集素對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響[21]。

1.3.4 Western blot分析

（1）RAW264.7 細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%平底面積時(shí)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至 1×106個(gè)/mL，接種于100 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。用不同處理方式處理巨噬細(xì)胞后，收集細(xì)胞并放置在-80 ℃保存[22]。

（2）

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，用SPSS 17.0 版統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳凝集素LAA提取純化

2.1.1 不同濃度（NH4）2SO4沉淀組分結(jié)果

圖1 不同濃度（NH4）2SO4沉淀組分的質(zhì)量

由圖1可知，濃度為40%（NH4）2SO4的沉淀組分凍干粉質(zhì)量最多，其次是濃度為50%（NH4）2SO4的沉淀組分，當(dāng)用濃度為80%的（NH4）2SO4沉淀時(shí)，凍干粉質(zhì)量小幅度提高，推測(cè)是由于部分蛋白溶解度較高造成，但與40%濃度差異顯著，所以選擇濃度為40%（NH4）2SO4沉淀組分進(jìn)行親和層析，進(jìn)一步純化黑木耳凝集素。

圖2 黑木耳凝集素親和層析

黑木耳凝集素粗品用PBS 溶解后，經(jīng)離心過(guò)濾后，與PSM-Sepharose 結(jié)合。裝柱洗脫，結(jié)果如圖2所示。先用pH 7.4 PBS 洗脫未與PSM-Sepharose 結(jié)合上的雜蛋白，隨著洗脫體積的上升，雜蛋白逐漸被洗脫掉；當(dāng)洗脫到24～33 mL 時(shí)，吸光值不再發(fā)生變化，說(shuō)明雜蛋白已經(jīng)完全被洗脫了。之后改用pH 3.0 Gly 洗脫，出現(xiàn)單一洗脫峰，說(shuō)明，經(jīng)過(guò)親和層析得到了黑木耳凝集素，將34～45 mL洗脫液用酸中和、合并，透析凍干，凍干粉為黑木耳凝集素，命名為L(zhǎng)AA。

2.1.2 黑木耳凝集素的純度檢測(cè)

由圖3 可看出樣品所在泳道為清晰的單一條帶，說(shuō)明試驗(yàn)所用方法分離到的黑木耳凝集素可能為單亞基蛋白，分子量初步推測(cè)約為20 kDa。食用菌中檢測(cè)到的凝集素多數(shù)為單亞基蛋白，分子量范圍較大，一般在10～100 kDa。通過(guò)純度鑒定可確定黑木耳凝集素LAA 已經(jīng)得到了純化。

圖3 SDS-PAGE電泳純度鑒定結(jié)果

2.2 LAA對(duì)抗炎因子的影響

結(jié)果如圖4 所示，處理 2 的 IL-1β 分泌量最多，為61.26 pg/mL；處理 3、處理 4、處理 5 的 IL-1β 分泌量分別為：55.23 pg/mL、48.33 pg/mL、38.28 pg/mL。處理2～5 的IL-1β 分泌量與對(duì)照相比均呈現(xiàn)極顯著性差異[圖4（A）]，雖然 IL-1β 分泌量隨著抑制劑PDTC 的濃度增大而有所降低，但仍然極顯著高于對(duì)照。

處理 2 的 IL-6 分泌量最高，為 572.32 pg/mL；處理 3、處理 4、處理 5 的 IL-6 分泌量分別為：527.28 pg/mL、442.58 pg/mL、313.49 pg/mL。處理2～5 的IL-6 分泌量隨著抑制劑PDTC 的濃度增大而有所降低，但仍然與對(duì)照存在極顯著差異[圖4（B）]。

處理2 的 TNF-α 分泌量最高，為 502.53 pg/mL；處理 3、處理 4、處理 5 的 TNF-α 分泌量分別為：488.30 pg/mL、453.18 pg/mL、428.72 pg/mL。處理2～5 的TNF-α 分泌量與對(duì)照呈現(xiàn)極顯著性差異[圖4（C）]。

圖4 表明，PDTC 可通過(guò)抑制 NF-κB 通路中三種炎癥因子的分泌而抑制該通路，隨著濃度增加抑制作用更強(qiáng)。但加入LAA 的處理組與對(duì)照組相比，三種炎癥因子的分泌量均顯著增加，雖然隨著抑制劑濃度增加分泌量有所下降，但足以說(shuō)明LAA 可以通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的產(chǎn)生。

圖4 PDTC對(duì)黑木耳凝集素LAA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響

2.3 LAA對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌NO的影響

圖5 PDTC對(duì)凝集素LAA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

結(jié)果如圖5，處理2 的NO 分泌量最高，為76.25 μmol/L；處理3、處理4、處理5的NO分泌量分別為67.92 μmol/L、55.42 μmol/L、47.08 μmol/L。處理2～5與處理1對(duì)照組相比，呈現(xiàn)極顯著性差異。雖然添加PDTC 可以抑制NO 分泌量，但是經(jīng)過(guò)LAA 處理后，NO的分泌量仍然高于對(duì)照的分泌量，表明黑木耳凝集素LAA可以通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)NO的分泌。

2.4 LAA 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)NF-κB通路關(guān)鍵蛋白的影響

考察黑木耳凝集素LAA 對(duì)RAW264.7細(xì)胞處理不同時(shí)間后，用Western blot 分析對(duì)細(xì)胞NF-κB p50和NF-κB p65 蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果如圖6 A 所示，與對(duì)照相比，黑木耳凝集素LAA 可以促進(jìn)NF-κB 蛋白的表達(dá)。通過(guò)對(duì)條帶灰度分析，結(jié)果如圖6中的B、C 所示，黑木耳凝集素LAA 處理RAW264.7細(xì)胞20 min 時(shí)NF-κB p50 蛋白表達(dá)量最多（圖6B）；黑木耳凝集素LAA 處理RAW264.7 細(xì)胞60 min 時(shí)NF-κB p65 蛋白表達(dá)量最多（圖6C）。結(jié)果表明：黑木耳凝集素LAA可以激活NF-κB通路。

圖6 黑木耳凝集素LAA作用對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

研究表明，不添加任何濃度的PDTC 抑制劑，用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA處理RAW264.7細(xì)胞后IL-1β 分 泌 量 為 61.26 pg/mL，IL-6 分 泌 量 為572.32 pg/mL，TNF-α 分泌量為502.53 pg/mL。在加入不同濃度PDTC 抑制劑后，再用10 μg/mL 黑木耳凝集素LAA 處理后，仍能分泌出不同量的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α，因此，LAA 可以促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生。

不添加任何濃度的PDTC 抑制劑，但用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA處理RAW264.7細(xì)胞后NO 分泌量為76.25 μmol/L，且添加不同濃度抑制劑后也仍然可以分泌NO，說(shuō)明黑木耳凝集素LAA 可以調(diào)節(jié)NO的分泌，具有免疫調(diào)節(jié)活性。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以推斷，黑木耳凝集素是通過(guò)NF-κB通路來(lái)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的作用發(fā)揮。從細(xì)胞通路上證明了黑木耳凝集素可誘導(dǎo)炎癥因子及免疫細(xì)胞活性的增強(qiáng)。目前黑木耳中研究較多的成分為黑木耳多糖及蛋白質(zhì)[23]，但這兩種成分在現(xiàn)有的研究中，均未有可以調(diào)節(jié)此免疫通路的報(bào)道，這一發(fā)現(xiàn)可為黑木耳的新藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。