拜小強(qiáng)，魏鎖成

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

牛輪狀病毒性腹瀉是由牛輪狀病毒(Bovine rotavirus)引起的牛常見(jiàn)多發(fā)病，多見(jiàn)于7日齡及以下的犢牛，以精神沉郁、食欲廢絕、消化道機(jī)能紊亂及水樣腹瀉為主要臨床癥狀[1].牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，自1969年Mebus[2]首次從Nebraska新生牛犢腹瀉糞便中分離到NCDV株以來(lái)，世界各地均有RV感染報(bào)道.1980年福建畜牧獸醫(yī)研究所首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)BRV[3]，之后在內(nèi)蒙古、西藏、黑龍江、新疆、四川等地也相繼發(fā)現(xiàn)BRV[4-6].新生犢牛RV發(fā)病率常達(dá)60%～80%，死亡率高達(dá)30%，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7].

1 牛輪狀病毒生物學(xué)特性

輪狀病毒體呈球形、無(wú)包膜，電鏡下形似輻射車(chē)輪狀而得名.病毒粒子直徑約70～75 nm，由外部衣殼、內(nèi)部衣殼和核心三層組成二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，內(nèi)含11個(gè)片段不連續(xù)的雙鏈RNA病毒基因組，分別編碼病毒的6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中第11個(gè)片段編碼2個(gè)蛋白(NSP5和NSP6)，其余基因片段均編碼1個(gè)蛋白.根據(jù)VP6蛋白抗原性的不同，病毒分為A～G共7個(gè)組，牛群感染A組輪狀病毒最為常見(jiàn)[8].根據(jù)VP4、VP7蛋白分為G型和P型，目前已發(fā)現(xiàn)有27個(gè)G型和35個(gè)P型[9].據(jù)報(bào)道，全球牛輪狀病毒流行優(yōu)勢(shì)株為G10P[11]、G10P[5]和G10P[1][10]，國(guó)內(nèi)則以G10和G6為優(yōu)勢(shì)流行毒株[11]，2008年常繼濤等[4]在國(guó)內(nèi)首次分離出G10型牛輪狀病毒.

輪狀病毒對(duì)理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，分離培養(yǎng)較為困難，易感細(xì)胞選擇和胰蛋白酶處理是細(xì)胞培養(yǎng)輪狀病毒的關(guān)鍵，常用培養(yǎng)效果最好的細(xì)胞是恒河猴腎傳代細(xì)胞MA-104[12]，已成功培養(yǎng)多種輪狀病毒株.輪狀病毒在各種動(dòng)物之間有一定的交叉感染，病人、動(dòng)物及隱性感染帶毒者是重要的傳染源，主要通過(guò)糞-口途徑傳播.牛感染RV潛伏期為12～96 h,近一半的犢牛腹瀉病例病程達(dá)1～8 d，病死率達(dá)10%～50%.主要病理特征為病毒感染絨毛上皮細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，造成小腸絨毛縮短，機(jī)能減退.該病傳播迅速，多發(fā)生于晚秋至早春的寒冷季節(jié)，衛(wèi)生條件不良、潮濕、驟冷或有疾病侵襲(如腺病毒、病毒性腹瀉病毒、產(chǎn)毒素性大腸桿菌交叉感染)等可促使病情加劇，病死率增高.BRV的病原學(xué)檢測(cè)方法包括經(jīng)典檢測(cè)技術(shù)(電鏡和免疫電鏡)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)(PAGE、ELISA)以及基因檢測(cè)技術(shù)等，RT-PCR方法因精準(zhǔn)、特異和簡(jiǎn)便而被廣泛采用，半套式RT-PCR可進(jìn)一步對(duì)輪狀病毒分型鑒定.

2 輪狀病毒疫苗研究進(jìn)展

輪狀病毒腹瀉對(duì)人類和動(dòng)物所造成的損害不可忽視，在全球已成為一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題.輪狀病毒感染普遍，目前尚無(wú)治療輪狀病毒感染的特效藥物[13].臨床上主要采取輔助對(duì)癥治療，如使用止瀉藥物減輕腹瀉癥狀，抗生素類藥物防止細(xì)菌繼發(fā)感染，微生態(tài)制劑維持腸道菌群平衡，靜脈注射葡萄糖鹽水和碳酸氫鈉溶液等補(bǔ)液以防止脫水和酸中毒等，但僅限治療，無(wú)法預(yù)防和徹底阻斷病毒傳播.接種輪狀病毒疫苗是預(yù)防輪狀病毒感染的有效手段，輪狀病毒疫苗的研究已取得了一定的成果.目前疫苗有單價(jià)人-牛重配疫苗Rotavac、五價(jià)人-牛重配株RV疫苗RotaTeq、單價(jià)羔羊LLR疫苗羅特威、單價(jià)HRV減毒疫苗Rotarix和Rotavin-M1.

2.1 非人源輪狀病毒疫苗

1969年Mebus首次分離BRV NCDV株[2]，該毒株被應(yīng)用于疫苗研制.1983年比利時(shí)RIT研究所Smith Nine通過(guò)胎牛腎細(xì)胞和猴腎細(xì)胞傳代154次獲得減毒株,首次制得口服輪狀病毒活疫苗RIT 4237[14]；1985年Vesikari Timo等[15]采用雙盲法測(cè)試疫苗臨床效果，進(jìn)一步證實(shí)口服減毒輪狀病毒疫苗具有免疫性；1986年美國(guó)費(fèi)城Wistar研究所和法國(guó)Merenx研究所在Pennsylvania腹瀉犢牛糞便中分離出BRV WC3株，經(jīng)非洲綠猴細(xì)胞系傳代12次制備出G6型牛株WC3減毒疫苗，臨床試驗(yàn)表明抗體反應(yīng)主要針對(duì)牛輪狀病毒，約50%的疫苗接種者血液中能產(chǎn)生免疫抗體[16]；G3型恒河猴輪狀病毒疫苗MMU-18006由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)從恒河幼猴腹瀉糞便中分離，經(jīng)猴腎細(xì)胞傳9代后獲得減毒株制備成口服疫苗[17].臨床試驗(yàn)表明該疫苗耐受性良好，有較高的免疫原性，新生兒服用后血清IgA抗體明顯升高，但服苗后有持續(xù)且較高的排毒率，感染異體風(fēng)險(xiǎn)增加.以上三種單價(jià)減毒疫苗由于不同國(guó)家地區(qū)保護(hù)性、流行株的血清型存在差異，動(dòng)物毒株異型免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定、保護(hù)率較低等因素，未能得到上市推廣.

1985年蘭州生物制品研究所從腹瀉新生羔羊腸內(nèi)容物分離出羊輪狀病毒，經(jīng)牛腎細(xì)胞傳代獲得穩(wěn)定傳代的適應(yīng)株蘭州羔羊輪狀病毒[18](Lanzhou Lamb Rotavirus,LLR株)，并用LLR株G10P[12]型減毒株制得口服輪狀病毒活疫苗，于2001年1月獲得中國(guó)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，商品名為羅特威.經(jīng)上市前大量臨床試驗(yàn)和上市后近20年的臨床應(yīng)用，羅特威對(duì)重癥RV腸胃炎保護(hù)效力為88%,住院病例保護(hù)率為85%，保護(hù)效果穩(wěn)定，未見(jiàn)不良反應(yīng)報(bào)道.該疫苗是全球最早獲得國(guó)家批準(zhǔn)的疫苗，也是目前我國(guó)上市的一種幼兒輪狀病毒單價(jià)疫苗，對(duì)我國(guó)控制輪狀病毒流行和降低輪狀病毒腹瀉發(fā)病率具有重大意義.

BRV NCDV株是最早分離出來(lái)的牛源輪狀病毒株，減毒培養(yǎng)后被用于單價(jià)(RIT 4237疫苗[14])和多價(jià)重組疫苗(五價(jià)BRV-PV[19])的研制.牛G6型輪狀病毒分離株NCDV-lincoln減毒疫苗于1973年在美國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)，犢?？诜臃N和肌肉注射均可獲得免疫保護(hù)，是目前世界范圍內(nèi)惟一的商品化牛輪狀病毒疫苗[20]，對(duì)犢牛輪狀病毒腹瀉預(yù)防有著十分重要的意義.常繼濤[21]研發(fā)的BRV(LLR-85和R191株)基因重組二價(jià)減毒疫苗和魏鎖成[22]研發(fā)的BRV GSB 01株VP7基因重組疫苗，初步驗(yàn)證均具有較好的免疫原性.

2.2 人源輪狀病毒減毒疫苗

1988年在美國(guó)Cincinnati腹瀉幼兒體內(nèi)分離出野生毒株，葛蘭素史克公司經(jīng)非洲綠猴腎細(xì)胞Vero連續(xù)傳代培養(yǎng)后，獲得穩(wěn)定人輪狀減毒RIX4414株G1P[8]型，商品名為Rotarix的單價(jià)口服減毒疫苗[23]，于2005年1月在墨西哥率先上市，后在歐洲等100多個(gè)國(guó)家獲得批準(zhǔn)上市，由于該疫苗免疫效果良好，對(duì)重癥RV腸胃炎保護(hù)效力為91%，住院病例保護(hù)率為85%，成為WHO推薦的輪狀病毒疫苗[24].

單價(jià)減毒疫苗Rotavin-M1，由越南衛(wèi)生部疫苗與生物制品研究中心從越南腹瀉兒童體內(nèi)分離獲得的HRV株G1P[8]型研制而成，2014年在越南批準(zhǔn)上市.Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明該疫苗的免疫原性和安全性與Rotarix相似.Dang等[25]在越南嬰幼兒中進(jìn)行不同劑量免疫原性研究，2個(gè)劑量方案和較高的滴度劑量接種免疫效果更佳，證實(shí)對(duì)越南嬰幼兒安全且具有免疫原性.

澳大利亞醫(yī)學(xué)家在輪狀病毒感染幼兒體內(nèi)分離獲得疫苗候選株型RV3株G3P[6]，2002年對(duì)制得的試驗(yàn)疫苗進(jìn)行Ⅱ期臨床雙盲隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果顯示54%受試者產(chǎn)生了免疫保護(hù)[26].

2.3 動(dòng)物-人輪狀病毒重組疫苗

四價(jià)恒河猴-人重配RV疫苗是第一個(gè)在美國(guó)批準(zhǔn)上市的輪狀病毒疫苗，商品名為RotaShield.1985年美國(guó)NIH的Kapikian以G3型恒河猴RRV株為親本，將人輪狀病毒G1、G2、G4型的VP7基因片段重組獲得RRV-TV株制得疫苗[27]，于1998年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)惠氏公司(Wyeth)生產(chǎn)，并推薦美國(guó)嬰兒進(jìn)行接種.然而上市推廣后發(fā)現(xiàn)服用該疫苗與嬰幼兒發(fā)生腸套疊病例有關(guān)聯(lián)，于1999年被迫撤出市場(chǎng)[28].此后，輪狀病毒疫苗研制將腸套疊癥狀作為嚴(yán)格安全評(píng)價(jià)項(xiàng).

五價(jià)人-牛重配株RV疫苗是美國(guó)惟一在售的輪狀病毒疫苗，商品名為Rota-Teq.該五價(jià)疫苗以牛的WC3株G6P[5]型為基礎(chǔ)毒株經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)制得[29]，其中四價(jià)重配病毒為HRV親本株血清型G1～G4外殼蛋白VP7和BRV WC3親本株血清型P7黏附蛋白VP4；第五價(jià)重配病毒為HRV親本株血清型P1A[8]黏附蛋白VP4和BRV WC3親本株血清型G6外殼蛋白VP7.Ⅲ期臨床試驗(yàn)的受試者中，該疫苗隨機(jī)接種后42天內(nèi)相關(guān)嚴(yán)重不良事件發(fā)生率≤0.1%，與對(duì)照組相比疫苗未顯著增加腸套疊的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)預(yù)防G1～G4、G9型導(dǎo)致的輪狀病毒嬰幼兒腹瀉保護(hù)率為74%[30].2006年2月Merck公司經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)疫苗上市，截止2017年在95個(gè)國(guó)家和地區(qū)投入使用.口服五價(jià)重配輪狀病毒減毒活疫苗(Vero細(xì)胞)中文商品名為樂(lè)兒德，于2018年4月12日經(jīng)中華人民共和國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，授權(quán)智飛生物公司推廣，成為我國(guó)引進(jìn)的首批輪狀病毒疫苗.

單價(jià)人-牛重配疫苗Rotavac是印度自主研制的輪狀病毒疫苗，也是首批完全在發(fā)展中國(guó)家發(fā)現(xiàn)、開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)的疫苗之一.1985年印度新德里醫(yī)院分離出人輪狀病毒親本株116E-G9株G9P[11]型，經(jīng)減毒弱化后與牛源VP4基因重配制得單價(jià)重配疫苗.經(jīng)4532名新生兒臨床Ⅲ期試驗(yàn)表明，重癥輪狀病毒胃腸炎兒童的保護(hù)效果達(dá)56%.Chandola等[31]研究表明Rotavac可以與其他兒童疫苗(脊髓灰質(zhì)炎、百日咳和破傷風(fēng)疫苗)一起安全使用.Rotavac疫苗于2015年在印度首次上市，由于經(jīng)濟(jì)適用被納入國(guó)家免疫計(jì)劃措施[32].

蘭州生物制品研究所利用人RV G2、G3、G4型和羊株LLR制得重配人-羊三價(jià)基因重配疫苗，已完成了Ⅲ期臨床觀察.黃騰[33]等對(duì)其安全性和免疫原性初步研究顯示安全性良好，并具有一定的免疫原性.武漢生物制品研究所研制的人-牛六價(jià)基因重配疫苗(Vero細(xì)胞)為六價(jià)UK重配株輪狀病毒活疫苗，已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床研究，正在我國(guó)河北、湖南、浙江和廣西4省開(kāi)展Ⅲ期臨床研究.此外國(guó)內(nèi)多家單位正在開(kāi)展五價(jià)及多價(jià)疫苗的研究，希望能覆蓋更多的血清型使得免疫群體得到更全面的保護(hù).

2.4 輪狀病毒生物技術(shù)疫苗

目前，在世界范圍內(nèi)上市的預(yù)防輪狀病毒的疫苗主要為減毒活疫苗和基因重組疫苗，生物技術(shù)疫苗因其安全性好、成本低等優(yōu)勢(shì)，成為新型輪狀病毒疫苗研制新趨勢(shì).生物技術(shù)疫苗是利用生物技術(shù)制備的分子水平的疫苗，包括基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨(dú)特性疫苗、基因工程活載體疫苗、DNA疫苗及轉(zhuǎn)基因植物疫苗等.生物技術(shù)疫苗在其他動(dòng)物病毒疫苗研制中已經(jīng)取得了一定的成果，如口蹄疫病毒VP1亞單位疫苗、豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗、豬瘟E2蛋白亞單位疫苗、偽狂犬病基因缺失疫苗等.

RV結(jié)構(gòu)黏附蛋白VP4、內(nèi)衣殼蛋白VP6、外衣殼蛋白VP7和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4已經(jīng)初步應(yīng)用到疫苗研究中，BRV疫苗開(kāi)發(fā)研究主要集中在基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、病毒樣顆粒疫苗(VLP)、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等方面，相關(guān)研究試驗(yàn)初步證實(shí)疫苗有效可行.生物技術(shù)疫苗作為輪狀病毒疫苗研制的新途徑，為更安全高效的疫苗研制提供可能，但由于病毒血清型和基因型眾多，抗原結(jié)構(gòu)功能和激發(fā)機(jī)制存在盲區(qū)，對(duì)人類和動(dòng)物機(jī)體的安全性和有效性還需進(jìn)一步證實(shí)后才能全面投產(chǎn).

3 牛輪狀病毒感染小鼠模型

輪狀病毒動(dòng)物模型對(duì)于病毒致病機(jī)理、疫苗研制、疫苗保護(hù)性驗(yàn)證以及藥物篩選有重要作用.用于研究BRV感染的動(dòng)物模型以母本未受感染且未攝入初乳的陰性新生犢牛為最佳，但新生犢牛篩選較為嚴(yán)苛且成本高昂，相對(duì)而言，小鼠模型具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、便于篩選、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，BRV小鼠模型包括感染后出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀的乳鼠腹瀉模型和感染后無(wú)明顯腹瀉的成年小鼠感染模型.

小鼠模型最初主要用于研究BRV致病機(jī)理、胃腸組織病變和感染臨床表現(xiàn).Ciarlet等[34]應(yīng)用BRV WC3株灌胃滴度為8×106FFU/mL病毒原液，致使5～21d Lewis大鼠有效感染，建立感染模型.通過(guò)觀察臨床癥狀、測(cè)定糞便和腸道中感染性病毒滴度、腸組織病理變化、免疫熒光檢測(cè)小腸切片抗原分布等方法，證實(shí)牛輪狀病毒感染大鼠在其腸道內(nèi)檢測(cè)到抗原，小腸上皮細(xì)胞發(fā)生空泡.該模型可以研究輪狀病毒的發(fā)病機(jī)理和腸道感染的分子機(jī)制，以及不同日齡小鼠輪狀病毒感染差異.

小鼠模型除了研究BRV感染和腹瀉機(jī)制之外，更多的被用于疫苗制備后獲得免疫情況初步評(píng)價(jià).Yang[35]等建立小鼠感染模型，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉接種牛輪狀病毒VP6 DNA疫苗可獲得免疫應(yīng)答和保護(hù)，表明通過(guò)VP6 DNA疫苗免疫可以獲得異源保護(hù).Diego[36]在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)了BRV C-486株G6P[1]型VP6蛋白，重組VP6多肽免疫幼鼠建立模型，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的被動(dòng)免疫保護(hù)，并證實(shí)分泌的乳汁中含有大量抗體可產(chǎn)生免疫保護(hù).Ijaz[37]建立了更為全面的小鼠感染輪狀動(dòng)物模型，用減毒和滅活的BRV進(jìn)行不同免疫途徑(灌胃、肌肉注射、乳腺內(nèi)皮注射)免疫母鼠，對(duì)哺乳的幼鼠體內(nèi)乳原性抗體產(chǎn)生情況進(jìn)行評(píng)價(jià).三種感染途徑免疫后均能在幼鼠血清中檢測(cè)到乳源抗體，前5周抗體滴度增加，后期逐漸下降，其中乳腺內(nèi)皮注射能產(chǎn)生最佳抗體應(yīng)答，IgG為主要抗體，其次是IgM和IgA，口服滅活的BRV免疫也能產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng).

此外，還可以利用小鼠模型尋求更多的途徑來(lái)抵抗BRV的感染.G?k?e[38]建立的輪狀病毒感染的小鼠模型中，HBC抗體和乳酸桿菌益生菌株的組合比單獨(dú)使用HBC更有效地減少了腹瀉.Peralta[39]建立不同濃度梯度BRV腹瀉乳鼠模型，研究雞卵黃中特異性免疫球蛋白IgY對(duì)牛輪狀病毒引起的腹瀉小鼠的被動(dòng)保護(hù)，用IgY處理過(guò)的小鼠感染BRV后腹瀉癥狀明顯減輕，使用IgY對(duì)抗由BRV引起的腹瀉方式是可行的.Lentz[40]利用BRV VP8基因與煙草重組在葉綠體中合成穩(wěn)定的C486 VP8蛋白，感染雌性小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，成功建立了小鼠模型，驗(yàn)證表明口服免疫孕鼠后所產(chǎn)仔鼠可免受輪狀病毒的攻擊.

張儉偉[41]將BRV CHLY株在恒河猴腎細(xì)胞系(MA-104)上增殖，制備病毒抗原液，甲醛滅活后加入佐劑制備疫苗，2次免疫昆明小鼠產(chǎn)生了較高水平IgG抗體，試驗(yàn)表明制備的牛輪狀病毒甲醛滅活疫苗具有較好的免疫原性，免疫后可顯著提高體內(nèi)特異性抗體水平.魏鎖成等[12]利用感染BRV GSB01株VP7基因構(gòu)建pET32a-VP7和pET32a-VP7-ltb表達(dá)重組蛋白，建立免疫小鼠模型.結(jié)果顯示免疫新生小鼠的保護(hù)率分別為86.4%和91.7%，利用該模型初步驗(yàn)證了亞單位疫苗的可行性.

4 總結(jié)與展望

牛輪狀病毒是犢牛病毒性腹瀉的主要病原體之一，環(huán)境中存在廣泛、成年牛只隱性感染、流行迅速、發(fā)病率高等特性.雖然目前多種檢測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)病毒的存在，但有研究證實(shí)可在種間傳播，給預(yù)防群發(fā)性感染帶來(lái)困難，目前尚無(wú)高效的預(yù)防措施完全阻止病毒傳播.感染牛只通常采用對(duì)癥療法，服用治療腹瀉藥物減輕癥狀，提高抵抗力，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡來(lái)緩解，并無(wú)特效藥物.

接種疫苗是預(yù)防輪狀病毒高效、經(jīng)濟(jì)的有效途徑.成熟的病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和適配的動(dòng)物模型是疫苗研制的前提，小鼠在篩選、飼養(yǎng)、取樣等方面都具有優(yōu)勢(shì)，鼠模型特別是幼鼠腹瀉模型被應(yīng)用于初期疫苗試驗(yàn).RV疫苗研制國(guó)內(nèi)外取得了較好的成果，我國(guó)目前有2種口服疫苗上市，用于預(yù)防幼兒免受輪狀病毒感染.BRV基因型眾多且易重排、型間疫苗不能完全交叉保護(hù)，給疫苗研制增加困難.BRV疫苗除美國(guó)USDA批準(zhǔn)生產(chǎn)的G6型單價(jià)BRV減毒疫苗外，我國(guó)無(wú)商品化疫苗.目前國(guó)內(nèi)研究者對(duì)BRV生物技術(shù)疫苗的探索研發(fā)已取得初步成效，期待研究者借助適配的動(dòng)物模型加速研究成果轉(zhuǎn)化.