王春瓊曾彥波李苓陳丹彭麗娟張燕

(1.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站,云南 昆明 650106；2.紅云紅河煙草(集團)有限責(zé)任公司會澤卷煙廠,云南 曲靖 654200)

前言

有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留常用的檢測方法為色譜法，如氣相色譜、高效液相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用、液-質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)[1-5]。開發(fā)和推廣適合我國農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷特點的檢測技術(shù)和方法，研究對現(xiàn)場農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留進行快速篩查的檢測儀器和系統(tǒng)，對保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要的意義。目前，主要速測的方法有速測箱、速測儀、速測卡和速測試劑盒等，這些方法按照技術(shù)原理的不同可分為化學(xué)法、酶抑制法和免疫法。其中，化學(xué)法由于靈敏度低而沒有普及；免疫分析法雖然靈敏度高、特異性強，但是抗體制備難度大，只能測定單一種類的農(nóng)藥殘留，較難實現(xiàn)廣譜性。我國在21世紀(jì)初，研究了酶抑制快速檢測方法在基層推廣應(yīng)用，此技術(shù)是基于氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶具有水解抑制作用的毒理學(xué)原理，建立的農(nóng)殘快速檢測法，具有使用方便、操作簡單和成本低廉等優(yōu)點，適合現(xiàn)場大量樣品的檢測和篩選[6,7]。

本文以酶抑制法為基礎(chǔ)，系統(tǒng)介紹了原理、酯酶種類、活性及其檢測方法，重點綜述了酶抑制法在農(nóng)藥殘留快速檢測上的應(yīng)用研究，并總結(jié)其存在問題，旨在為今后農(nóng)藥殘留快速檢測方法相關(guān)研究提供參考。

1 酶抑制法的基本原理

氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)藥為神經(jīng)毒劑，會對人體、哺乳動物和昆蟲神經(jīng)傳遞介質(zhì)中的乙酰膽堿酯酶水解作用進行抑制，使乙酰膽堿酯酶的水解中斷，導(dǎo)致乙酰膽堿底物在體內(nèi)累積，阻礙神經(jīng)的正常傳導(dǎo)，引發(fā)中毒甚至死亡。酶抑制法便是基于氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的這一毒理學(xué)原理應(yīng)用到農(nóng)殘檢測中。酯酶抑制率與氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)藥濃度呈正相關(guān)，各種動物及植物都可用作酶源。將樣品與酯酶混合反應(yīng)，若樣品不含農(nóng)殘或含量極少，酯酶活性不受抑制，可將底物正常水解，通過電化學(xué)方法或光度法檢測水解底物；反之，若樣品農(nóng)殘含量很高，酯酶活性受到抑制，不能水解底物或水解得較慢，通過測定抑制率推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農(nóng)藥及濃度。

2 常用酯酶種類

2.1 昆蟲膽堿酯酶

昆蟲體內(nèi)只有乙酰膽堿酯酶1種。據(jù)報道，從家繩、蜜蜂及麥二叉蚜等昆蟲中得到的乙酰膽堿酯酶已成功進行了分離、純化或部分純化。昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶主要分布在胸部和頭部。敏感家蠅由于生活史短(16～18d)，容易飼養(yǎng)，通常被作為酶源材料。提取方法：在-20℃將家蠅冷凍至死后，加入少許干冰和磷酸緩沖液，勻漿、離心，取上清液過濾后冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物血清酯酶

動物血液乙酰膽堿酯酶含量較高，且來源廣泛，廉價易得。已從鴨、馬和牛等動物血清中成功提取并純化出較高活力的乙酰膽堿酯酶。提取方法：將剛抽取的動物血液注入無抗凝劑的試管中，恒溫使血液凝團滲出血清，取血清離心，上清液冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 動物肝酯酶

雞肝和豬肝常作為乙酰膽堿酯酶的酶源材料，分離純化方法與動物血清相同。豬肝中提取的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的敏感性較好。提取方法：動物新鮮肝臟加蒸餾水勻漿、離心，取上清液在冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 植物酯酶液

20世紀(jì)80年代以來，人們開始嘗試使用植物酶源替代動物酶源。植物酯酶活性雖不如動物酯酶高，但來源豐富、取材和制備方便、價廉易得、提取和保存較為方便、成本較低。研究結(jié)果表明，糧谷類的酯酶較其它植物含量較高，其中小麥的酯酶活性較高。提取方法：取市售面粉，按比例加入蒸餾水，振蕩、離心，取上清液過濾，濾液冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3 檢測方法

3.1 薄層-植物酶抑制法

農(nóng)藥在薄板上展開后，噴面粉酶液，因為農(nóng)藥抑制了斑點上的酶活性導(dǎo)致基質(zhì)不能水解，而其它部分不被抑制，仍可使基質(zhì)水解，故噴顯色基質(zhì)溶液后可以顯色，通過斑點面積法進行半定量或使用薄層掃描儀進行定量分析。

3.2 速測卡法

農(nóng)藥速測卡是在長方形紙條上，對稱貼圓形藥片白色、紅色各1片。白色藥片含膽堿酯酶，紅色藥片含2,6-二氯靛酚乙酸酯，在膽堿酯酶的催化下，2,6-二氯靛酚乙酸酯迅速水解，產(chǎn)生乙酸和2,6-二氯靛酚(藍(lán)色)。若含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，膽堿酯酶的活性便會受到抑制而不水解，沒有藍(lán)色物質(zhì)生成。根據(jù)白色藥片是否變藍(lán)，可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農(nóng)藥及濃度。

3.3 分光光度法

3.3.1 丁酰膽堿酯酶法

碘化硫代丁酰膽堿在丁酰膽堿酯酶的催化下迅速水解，產(chǎn)生丁酸和碘化硫代膽堿，加入顯色劑二硫代二硝基苯甲酸，與碘化硫代膽堿發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)物呈黃色，在不同時間用分光光度計測定412nm處的吸光度變化值，計算抑制率。通過抑制率可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農(nóng)藥及濃度。

3.3.2 乙酰膽堿酯酶法

在弱堿性溶液中，碘化硫代乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶的催化下迅速水解，產(chǎn)生碘化硫代膽堿。碘化硫代膽堿通過還原反應(yīng)使藍(lán)色的2,6-二氯靛酚褪色，褪色程度與酯酶活性呈正相關(guān)，在600nm處測定吸光度，酶活性與吸光度值呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)樣品含氨基甲酸酯或有機磷類農(nóng)藥時，會抑制酯酶活性，吸光度值越高。據(jù)此可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農(nóng)藥及濃度。

4 酶抑制法在煙草農(nóng)藥殘留快速檢測中的應(yīng)用研究

酶抑制法具有操作簡單、檢測快速、不需要大型儀器、檢測成本低廉等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場大批樣品的農(nóng)殘快速篩查。1985年美國報道了一種能用于快速檢測田間有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的酶片，檢測范圍為0.1～10mg·kg-1。美國Neogen公司于1998年又推出了一種商品化試紙片，已經(jīng)被用于空氣、水、土壤和食品等樣品農(nóng)殘測定，國內(nèi)市場也陸續(xù)推出如“農(nóng)藥速測卡”和“農(nóng)藥檢測卡”等產(chǎn)品。

國外方面，Young Ah Kim等[8]選用Hybond N+作酶的載體、苯基乙酸酯為酶促反應(yīng)底物，用涂有AChE的試紙條檢測實際樣品中氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)殘的含量，靈敏度為0.01～0.05mg·kg-1。Wang等[9]利用酯酶比色法對市售生菜中的5種有機磷農(nóng)藥進行檢測。結(jié)果表明，小麥面粉中提取的酯酶對敵敵畏、甲胺磷、樂果、辛硫磷及馬拉硫磷的檢出限依次為0.17mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.96mg·kg-1、1.70mg·kg-1。Ingrid Walt等[10]用酶標(biāo)儀實現(xiàn)了多樣品中對氧磷和毒死蟀農(nóng)殘含量的測定，檢出限依次為0.04mg·mL-1和2.6mg·mL-1。Supanat[11]基于酶抑制原理，制備了西維因農(nóng)藥生物傳感器，檢測范圍為0.001～1mmol·L-1。Reddy[12]利用酶解釋放對硝基苯酚可抑制酶活性的特性，制備了測定甲基對硫磷的生物傳感器法，線性范圍為10～70ppb，檢出限為26.32ppb。Salam[13]以乙酰硫代膽堿碘化物為底物，利用殺蟲劑可抑制乙酰膽堿酯酶的特性，制備了電化學(xué)酶抑制傳感器，可用于稻田中殺蟲劑測定。Poacnik等[14]制備了一種光熱生物傳感器，用來檢測色拉、洋蔥等樣品中氨基甲酸酯和有機磷復(fù)合物，與GC-MS一致性較好。Tschmelak[15]制備了一種光學(xué)免疫傳感器，利用全內(nèi)反射熒光設(shè)備來測量水樣中的農(nóng)藥含量，靈敏度達到ng·L-1，可用作環(huán)境分析中的監(jiān)測和預(yù)警。

國內(nèi)方面，王繼軍[16]將自制植物酯酶涂覆在載體上的微孔內(nèi)壁表面，制得農(nóng)藥快速檢測板，靈敏度為0.1～0.01mg·kg-1。于基成[17]等通過比較大豆、玉米、綠豆等10種植物中植物酯酶活性，系統(tǒng)研究了酶促反應(yīng)條件，建立了快速檢測蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留的酶抑制法。何穎[18]等利用酶抑制分光光度法檢測蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留量，回收率分別達到97%、101%和99%。錢立[19]等將電動流動分析與酶抑制法結(jié)合，研究了一種測定池塘水中氨基甲酸酯和有機磷類農(nóng)殘折合總量的方法，每小時可測24個樣品。

姜彬等[20]基于酶抑制法制備出用于檢測有機磷農(nóng)藥的電流型生物傳感器，檢測對硫磷、辛硫磷和氧化樂果的線性范圍分別為5×10-10×10-5mol·L-1、10-9～10-5mol·L-1和5×10-9～10-5mol·L-1，檢出限分別為3.24×10-10mol·L-1、1.26×10-10mol·L-1和6.60×10-9mol·L-1。劉濤[21]成功制備了用于測定毒死蜱、丙溴磷和馬拉硫磷的酪氨酸酶生物傳感器，檢測范圍為0.25～10ppb、l～10ppb和5～30ppb，檢出限分別為0.2ppb、0.8ppb和3.0ppb。

5 存在問題

酶抑制技術(shù)經(jīng)多年發(fā)展，在農(nóng)殘快速篩查上已得到廣泛運用，但仍存在諸多問題。酶抑制法只適用于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測，且靈敏度有限；酶抑制法測定準(zhǔn)確度的影響因素很多，如酶和底物來源及濃度、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時間和天然抑制劑等，因此酶法測定的重現(xiàn)性不理想；常用的幾種酯酶中，乙酰膽堿酯酶的制備比較困難，并且保存時間短，酶失活較嚴(yán)重，酶的來源不穩(wěn)定，不同來源的酶造成檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性較差。丁酰膽堿酯酶及植物酯酶雖然易得，但測定時專一性較差，假陽性率較高。