宰文靜， 陳捷亮， 袁正宏

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院， 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)健委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032

HBV持續(xù)感染所致慢性乙型肝炎(CHB)嚴(yán)重危害人類健康。每年全球約有60萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)肝硬化、肝衰竭以及原發(fā)性肝癌等疾病。目前臨床上的治療藥物包括干擾素(IFN)和核苷(酸)類似物(NAs)，可有效抑制HBV轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，但無(wú)法徹底清除HBV，且存在治療響應(yīng)率低或抗原陰轉(zhuǎn)率低等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈[1]。

HBV cccDNA作為HBV關(guān)鍵復(fù)制中間體及其轉(zhuǎn)錄復(fù)制模板，經(jīng)由HBV從頭感染和胞內(nèi)復(fù)制回補(bǔ)兩種途徑形成，在感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)蓄積為cccDNA池，其持續(xù)存留是乙型肝炎慢性化和難以治愈的關(guān)鍵。現(xiàn)階段研發(fā)的抗-HBV藥物靶向HBV生命周期多個(gè)環(huán)節(jié)，包括入胞抑制劑、HBsAg抑制劑、衣殼蛋白(HBc)組裝調(diào)節(jié)劑(CpAM)、HBV聚合酶(Pol)抑制劑、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向藥物、RNA干擾技術(shù)靶向HBV RNA等。其中入胞抑制劑和NAs等理論上可通過(guò)有效阻斷肝細(xì)胞發(fā)生再感染及病毒復(fù)制從而切斷cccDNA生成途徑，但對(duì)于肝細(xì)胞核內(nèi)既有cccDNA池，目前尚缺少針對(duì)性的有效治療手段。

基于HBV cccDNA持續(xù)沉默是CHB“功能性治愈”的目標(biāo)，深入了解cccDNA相關(guān)調(diào)控機(jī)制并尋找靶向策略是研究重點(diǎn)和核心任務(wù)。本文簡(jiǎn)單介紹cccDNA基本生物學(xué)特性，重點(diǎn)回顧目前對(duì)其轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控機(jī)制及相關(guān)宿主因子的認(rèn)知，并對(duì)cccDNA沉默清除的可能途徑和靶向調(diào)控策略進(jìn)行討論。

1 HBV cccDNA生成與代謝機(jī)制及特性

HBV cccDNA經(jīng)由松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)修復(fù)及回補(bǔ)途徑形成，具體環(huán)節(jié)包括：去除與負(fù)鏈DNA 5′端共價(jià)結(jié)合的Pol以及5′-flap、去除正鏈DNA 5′端RNA引物和補(bǔ)齊并連接滯后鏈的缺口。去除與rcDNA共價(jià)結(jié)合的Pol形成去蛋白的rcDNA中間體是cccDNA形成的關(guān)鍵步驟，該過(guò)程可能由酪氨酸-DNA磷酸二酯酶2參與調(diào)節(jié)[2]。Flap內(nèi)切酶1是一種flap結(jié)構(gòu)特異性的核酸內(nèi)切酶，可能參與rcDNA負(fù)鏈DNA 5′-flap以及正鏈DNA上RNA 引物的去除[3]。其他參與cccDNA形成的因子還包括Polκ、Polα等宿主DNA聚合酶、DNA連接酶Ⅰ/Ⅱ以及DNA拓補(bǔ)異構(gòu)酶Ⅰ/Ⅱ等。近期一項(xiàng)體外生化系統(tǒng)的研究[4]提示，HBV cccDNA的形成至少需要包括人增殖細(xì)胞核抗原、復(fù)制因子C復(fù)合物、Polδ、flap內(nèi)切酶1和ATP依賴性DNA連接酶Ⅰ 5個(gè)因子參與。

已有研究[5]表明，每個(gè)感染肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA拷貝數(shù)在1至幾百之間不等且存在波動(dòng)，平均約1.05個(gè)拷貝。cccDNA池的蓄積受限于病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和回補(bǔ)的效率，其受宿主和病毒因子嚴(yán)格控制。HBV大胞膜蛋白S缺失可促進(jìn)核內(nèi)cccDNA數(shù)量增加，此外，宿主固有免疫識(shí)別病毒核酸亦被報(bào)道參與cccDNA池的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[6]。研究[7]表明，cccDNA伴隨CHB感染的整個(gè)自然史，即使發(fā)生抗原血清轉(zhuǎn)換或急性感染轉(zhuǎn)歸患者體內(nèi)也存在少量cccDNA?？共《局委熇碚撋贤茰y(cè)可通過(guò)阻斷cccDNA新生而逐步耗竭或通過(guò)恢復(fù)免疫以間接降低cccDNA含量，但臨床研究[8]表明很難徹底清除cccDNA。有數(shù)學(xué)模型推算體內(nèi)NAs持續(xù)治療下完全清除肝內(nèi)cccDNA至少需15年[9]。

盡管如此，體外研究[10]表明HBV cccDNA半衰期約35～57 d；近期一項(xiàng)研究[11]通過(guò)測(cè)定抗病毒治療中患者血清HBV RNA耐藥突變LAMR(rtM204V)以動(dòng)態(tài)反應(yīng)肝內(nèi)cccDNA池的更新速度，結(jié)果提示肝內(nèi)cccDNA更新速率約5.6～11.1周，遠(yuǎn)快于之前估計(jì)的數(shù)十年。上述研究提示有可能通過(guò)cccDNA耗竭的方式實(shí)現(xiàn)cccDNA的降解清除。

2 HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及相關(guān)宿主因子

已有研究[12]表明通過(guò)與宿主組蛋白、非組蛋白及病毒結(jié)構(gòu)蛋白core等結(jié)合，HBV cccDNA可進(jìn)一步組裝成微染色體。與EB病毒、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒等DNA病毒episome在細(xì)胞核內(nèi)易形成異染色質(zhì)樣狀態(tài)不同，HBV cccDNA微染色體的轉(zhuǎn)錄往往較為活躍，存在持續(xù)病毒抗原表達(dá)和病毒復(fù)制[13]。高分辨率染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(Hi-C)研究[14]結(jié)果顯示，HBV cccDNA在細(xì)胞核內(nèi)主要分布于常染色質(zhì)附近，且趨向于分布在富含Cfp1的CpG島附近，從而有利于其自身轉(zhuǎn)錄復(fù)制。HBV cccDNA本身也包含3個(gè)CpG島(CpG島Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ)，其DNA甲基化狀態(tài)參與調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制。宿主DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1/2/3可通過(guò)促進(jìn)病毒DNA甲基化修飾參與cccDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。

現(xiàn)有研究提示，cccDNA轉(zhuǎn)錄受宿主因子和病毒蛋白的雙重調(diào)控。研究[16]表明，HBV基因組包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及核受體結(jié)合位點(diǎn)，主要包括增強(qiáng)子Ⅰ、增強(qiáng)子Ⅱ以及核心啟動(dòng)子區(qū)域。肝特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF1/3/4以及核受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α-維甲酸X受體α、法尼醇X受體等均可識(shí)別并調(diào)控核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。cAMP反應(yīng)元件(CRE)結(jié)合蛋白(CREB)可識(shí)別HBV增強(qiáng)子Ⅰ區(qū)域HBV-CRE保守序列并介導(dǎo)肝特異性病毒轉(zhuǎn)錄[17]。宿主RNA Pol Ⅱ可識(shí)別cccDNA上順式作用元件，介導(dǎo)HBV基因組轉(zhuǎn)錄[18]。其他轉(zhuǎn)錄因子包括ATF、YY1、SP1、AP1、TBP等以及轉(zhuǎn)錄共激活因子如CRTC1、C/EBP、p300/CBP等也均被證明參與cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

另外，cccDNA轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可能與其上結(jié)合組蛋白H3/H4的表觀修飾狀態(tài)有關(guān)。體外HBV感染細(xì)胞染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation,ChIP)-seq實(shí)驗(yàn)[19]結(jié)果表明，cccDNA上組蛋白大多為活化性位點(diǎn)修飾(H3K4me3、H3K27ac和H3K122ac)，且主要分布在啟動(dòng)子區(qū)域，缺少抑制性組蛋白修飾。針對(duì)CHB臨床患者肝穿組織ChIP-seq研究[20]發(fā)現(xiàn)，cccDNA表觀修飾狀態(tài)存在異質(zhì)性，可能與肝內(nèi)病理狀態(tài)及免疫抑制情況有關(guān)。表觀調(diào)控因子通過(guò)調(diào)節(jié)cccDNA上組蛋白甲基化、乙?；刃揎梾⑴c調(diào)節(jié)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，包括轉(zhuǎn)錄活躍(“開放”)和轉(zhuǎn)錄抑制(“關(guān)閉”)兩種狀態(tài)。本課題組前期研究[21]發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5可通過(guò)促進(jìn)cccDNA上H4R3甲基化修飾(H4R3me2)表觀調(diào)控cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)可與HBc以及Brg1依賴的hSWI/SNF染色質(zhì)重塑子共同作用，抑制RNA Pol Ⅱ與cccDNA結(jié)合，從而抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄。還有研究[22]表明組蛋白去乙酰化酶SIRT3通過(guò)與SUV39H1共同作用抑制SETD1A募集從而促進(jìn)H3K9甲基化修飾(H3K9me3)并降低H3K4甲基化水平(H3K4me3)，由此減少cccDNA上RNA Pol Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合并限制cccDNA轉(zhuǎn)錄。其他宿主因子包括HDAC1、EZH2、PRMT1、SIRT1、SETDB1、PCAF/GCN5等也被報(bào)道參與HBV cccDNA表觀及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3 HBV cccDNA沉默途徑及策略

3.1 宿主限制因子 研究表明，病毒感染過(guò)程中病毒與宿主之間存在多種相互作用，與病毒的維持復(fù)制和致病密切相關(guān)，同時(shí)宿主細(xì)胞內(nèi)也存在多種拮抗機(jī)制抑制病毒轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，相關(guān)的宿主蛋白稱為“限制因子”(antiviral restriction factor, ARF)。ARF作為固有免疫系統(tǒng)的一部分，在多種病毒領(lǐng)域被廣泛研究。其主要的特征包括：(1)具有抗病毒功能效應(yīng)；(2)通常由IFN或病毒感染所誘生；(3)可被病毒蛋白拮抗；(4)具有基因突變率高(“positive selection”)的遺傳學(xué)特征；(5)無(wú)病毒感染時(shí)其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平受嚴(yán)格調(diào)控；(6)某些情況下其在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)。部分ARF特異性針對(duì)特定類型的病毒，部分則具有廣譜的抗病毒效應(yīng)[23]。目前已有多種針對(duì)HBV的宿主限制因子被鑒定，包括SMC5/6、Mx2、APOBEC3C、TRIM22、ZAP、SAMHD1、Myd88等，但直接針對(duì)cccDNA的較少。IFN誘生基因Mx2可以通過(guò)抑制HBV RNA轉(zhuǎn)錄以及病毒復(fù)制發(fā)揮抗HBV效應(yīng)，其也可通過(guò)抑制回補(bǔ)的方式降低感染肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的含量[24]。鋅指蛋白ZAP可識(shí)別HBV前基因組RNA末端冗余序列(nt 1820-1918)并促進(jìn)HBV RNA轉(zhuǎn)錄后降解[25]。其他一些轉(zhuǎn)錄因子和表觀調(diào)控因子如NF-κB、STAT1/2、PROX1、SETDB1、ZHX2、DDX3等也被發(fā)現(xiàn)作為HBV宿主限制因子，可直接或間接導(dǎo)致HBV轉(zhuǎn)錄抑制或沉默。進(jìn)一步篩選、鑒定HBV cccDNA特異性宿主限制因子可能為開發(fā)新型抗-HBV藥物提供新的靶點(diǎn)及策略。

3.2 表觀沉默 鑒于cccDNA轉(zhuǎn)錄活性受表觀因子調(diào)控，通過(guò)表觀調(diào)控可能使轉(zhuǎn)錄活躍的cccDNA轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔顒?dòng)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)CHB功能性治愈。IFN可通過(guò)改變cccDNA的表觀修飾狀態(tài)發(fā)揮對(duì)cccDNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制的抑制，而對(duì)cccDNA直接清除降解的效應(yīng)較弱。研究[26-27]表明，IFNα對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的抑制與其減少STAT1和STAT2復(fù)合物在cccDNA上結(jié)合、以及減少cccDNA微染色體上活化性組蛋白乙?；揎?H3K9ac、H3K27ac)有關(guān)；此外，IFNα還可通過(guò)招募其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物PRC2(YY1和EZH2)、HDAC1和hSirt1等因子與cccDNA結(jié)合，從而表觀抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄。其他細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β等也被報(bào)道具有類似效應(yīng)。IL-6可以使cccDNA上組蛋白乙?；瘻p少及轉(zhuǎn)錄因子HNF1α、HNF4α結(jié)合減少，并促使STAT3從cccDNA重新分布至宿主靶基因，從而表觀沉默cccDNA[28]。利用現(xiàn)有的表觀調(diào)節(jié)劑可能有利于HBV cccDNA直接靶向沉默治療，從而減輕HBV感染所致肝臟病理?yè)p害或可部分恢復(fù)宿主免疫。例如，HDAC1抑制劑被證明可以通過(guò)直接靶向cccDNA轉(zhuǎn)錄所需宿主因子包括HDACs抑制鴨HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄，但該效應(yīng)在不同的細(xì)胞模型中尚存在爭(zhēng)議[27]。然而已鑒定的cccDNA表觀調(diào)控因子往往對(duì)宿主基因也具有廣泛調(diào)控作用，如何篩選、鑒定HBV cccDNA特異性的表觀調(diào)控靶點(diǎn)仍有待解決。此外需關(guān)注，表觀調(diào)控的手段僅能實(shí)現(xiàn)cccDNA的轉(zhuǎn)錄沉默而不能降解清除cccDNA，特定情況下如抗腫瘤藥物或免疫抑制劑治療期間可能會(huì)導(dǎo)致HBV的再激活[29]。

3.3 靶向病毒蛋白HBx和HBc 已知，病毒蛋白HBx和HBc在參與cccDNA微染色體結(jié)構(gòu)組裝、轉(zhuǎn)錄表觀調(diào)控以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持等方面均發(fā)揮重要作用，其中HBx可以通過(guò)與多種宿主因子直接作用并招募其結(jié)合至cccDNA微染色體上，從而有利于病毒自身的轉(zhuǎn)錄復(fù)制。例如，HBx作為cccDNA轉(zhuǎn)錄共激活因子，可促進(jìn)CREB二聚化及轉(zhuǎn)錄共激活因子CRTC1、p300/CBP等募集激活cccDNA轉(zhuǎn)錄[30]。HBx也可通過(guò)招募p300/CBP、PCAF/GCN5抑制HDAC1、SIRT1等表觀因子與cccDNA結(jié)合并促進(jìn)cccDNA上H3/H4乙?；揎棧蛘{(diào)控cccDNA轉(zhuǎn)錄活性[31]。此外，HBx可通過(guò)多種途徑拮抗宿主限制因子。例如，SMC5/6可以與HBV cccDNA結(jié)合并抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄，HBx被證明可以通過(guò)劫持宿主CRL4 E3連接酶系統(tǒng)促進(jìn)SMC5/6經(jīng)蛋白酶體途徑降解，從而有利于cccDNA轉(zhuǎn)錄[32]。通過(guò)藥物靶向HBx，可能有利于降低cccDNA轉(zhuǎn)錄活性或使其表觀沉默，同時(shí)解除HBx對(duì)宿主限制因子的降解作用，促進(jìn)cccDNA的沉默或清除。廣譜性抗感染藥物硝唑尼特(NTZ)被報(bào)道可阻斷HBx-DDB1復(fù)合物形成。進(jìn)一步通過(guò)高通量藥物篩選、設(shè)計(jì)抗體等方式尋找靶向HBx的藥物可能有助于實(shí)現(xiàn)乙型肝炎功能性治愈。病毒核心蛋白HBc/core與cccDNA直接結(jié)合，使微染色體結(jié)構(gòu)更致密，其核小體間距較宿主染色體縮短10%，可能與cccDNA穩(wěn)定維持相關(guān)。HBc可通過(guò)與cccDNA上富含CpG區(qū)域結(jié)合促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄。研究[33]表明，HBc可介導(dǎo)APOBEC3A/B結(jié)合至cccDNA并導(dǎo)致cccDNA脫氨基及降解。CpAM可阻止核衣殼的組裝或促進(jìn)結(jié)構(gòu)異常的核衣殼裝配，可有效抑制HBV DNA水平并阻止rcDNA形成cccDNA；同時(shí)可能導(dǎo)致既有cccDNA結(jié)構(gòu)功能異?；蛞种破滢D(zhuǎn)錄[34]。當(dāng)前已有部分CpAM類藥物正在進(jìn)行二期臨床評(píng)價(jià)，其與NAs聯(lián)合使用是否具有協(xié)同抗病毒效應(yīng)有待進(jìn)一步觀察研究。

4 HBV cccDNA清除途徑及策略

4.1 非殺細(xì)胞清除cccDNA 研究[35]表明，急性乙型肝炎感染轉(zhuǎn)歸的過(guò)程中，存在非殺細(xì)胞清除cccDNA的現(xiàn)象。在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中輸入HBsAg特異性CD8+殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)可以顯著降低肝細(xì)胞內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，同時(shí)HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞的比例由75%降低至約為0，而發(fā)生肝損傷的程度顯著低于清除所有感染細(xì)胞所需殺傷的肝細(xì)胞數(shù)，提示CTL可能通過(guò)非殺細(xì)胞的方式促進(jìn)HBV RNA及DNA的清除。對(duì)HBV急性感染黑猩猩中HBV清除與肝損傷的動(dòng)態(tài)觀察[36]結(jié)果顯示，黑猩猩肝內(nèi)HBV DNA及cccDNA的急性清除發(fā)生在CTL浸潤(rùn)之后、肝損傷發(fā)生之前，提示CTL分泌的細(xì)胞因子及其下游的調(diào)節(jié)因子可能介導(dǎo)了cccDNA的降解或清除。IFNγ、TNFα作為CTL分泌的細(xì)胞因子，已被證實(shí)可以通過(guò)非殺細(xì)胞的方式促進(jìn)小鼠模型中HBV DNA以及cccDNA的清除[37]。采用IFNγ及TNFα單克隆抗體處理HBV轉(zhuǎn)基因小鼠可以阻斷輸入的HBsAg特異性CTL對(duì)HBV RNA和HBV DNA的非殺細(xì)胞清除效應(yīng)[38]。APOBEC家族蛋白作為IFN誘生基因，被報(bào)道可能是非殺細(xì)胞清除cccDNA中的關(guān)鍵介導(dǎo)因子[39]。高劑量IFNα或LTβR激動(dòng)劑誘生的APOBEC3A/3B(A3A/A3B)可以與病毒蛋白core相互作用并被募集至cccDNA上，通過(guò)誘導(dǎo)cccDNA負(fù)鏈脫氨基作用促進(jìn)cccDNA的降解，但仍存在爭(zhēng)議?？梢哉f(shuō)介導(dǎo)非殺細(xì)胞清除cccDNA的關(guān)鍵通路和效應(yīng)因子仍不明確，如何研究并揭示相關(guān)機(jī)制并用于HBV cccDNA靶向清除是亟需解決的問(wèn)題。

4.2 殺細(xì)胞清除感染肝細(xì)胞 除了非殺細(xì)胞清除cccDNA之外，免疫介導(dǎo)的對(duì)感染肝細(xì)胞的殺傷是cccDNA清除的另一關(guān)鍵途徑。研究[40]表明，急性感染恢復(fù)時(shí)期，CTL是介導(dǎo)HBV清除的主要效應(yīng)細(xì)胞。然而在CHB患者體內(nèi)往往存在T淋巴細(xì)胞功能紊亂或功能性耗竭。HBV特異性免疫功能紊亂是乙型肝炎慢性化的主要原因之一，可能與抑制性的細(xì)胞因子如IL-10分泌、免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1表達(dá)上調(diào)以及外周長(zhǎng)期病毒抗原刺激導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞疲勞或功能紊亂有關(guān)[41]。開發(fā)調(diào)節(jié)HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的治療方法有利于免疫控制HBV感染，從而實(shí)現(xiàn)乙型肝炎“功能性治愈”?，F(xiàn)有的免疫調(diào)節(jié)手段包括應(yīng)用模式識(shí)別受體激動(dòng)劑如TLRs激動(dòng)劑和RIG-Ⅰ激動(dòng)劑、阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體如使用抗PD-1/PD-L1從而恢復(fù)HBV特異性CTL功能、研發(fā)治療性疫苗(HBsAg/PreS、HBcAg等蛋白疫苗、DNA疫苗以及病毒載體疫苗等)、采用基因編輯技術(shù)制備HBV特異性CAR-T或TCR-T細(xì)胞并回輸至患者體內(nèi)等[42]。此外，通過(guò)抗病毒藥物或特異性抗體降低患者體內(nèi)HBV抗原表達(dá)也有利于部分緩解T淋巴細(xì)胞功能耗竭的情況。通過(guò)免疫調(diào)節(jié)恢復(fù)T淋巴細(xì)胞功能可能實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈，存在的風(fēng)險(xiǎn)是可能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷甚至急性肝衰竭。

4.3 肝細(xì)胞自我更新、cccDNA分裂丟失 HBV cccDNA盡管在非分裂肝細(xì)胞中非常穩(wěn)定，但在肝細(xì)胞分裂過(guò)程中其含量會(huì)快速降低[43]，其可能機(jī)制包括：(1)cccDNA不能通過(guò)滾環(huán)復(fù)制的方式隨宿主染色質(zhì)復(fù)制；(2)與EB病毒、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒、人乳頭瘤病毒等DNA病毒可通過(guò)編碼蛋白將病毒episome錨定在宿主染色質(zhì)上[44]不同，cccDNA無(wú)類似功能病毒蛋白，因而導(dǎo)致其在細(xì)胞分裂過(guò)程中易被丟失或稀釋。HBV急性感染恢復(fù)時(shí)期存在肝臟自我修復(fù)、肝細(xì)胞分裂更新，研究[45-46]證實(shí)該過(guò)程伴隨著cccDNA含量的顯著降低。在CHB治療過(guò)程中需注意的是，為保證肝細(xì)胞分裂過(guò)程中新生的肝細(xì)胞不被HBV再次感染和進(jìn)行HBV復(fù)制，采用HBV入胞抑制劑或NAs可能是一種策略[47]。

4.4 基因編輯工具靶向HBV cccDNA 基因編輯工具包括ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等均被證明可以靶向編輯HBV cccDNA。通過(guò)誘導(dǎo)插入或缺失突變導(dǎo)致HBV蛋白表達(dá)異常、從而影響病毒復(fù)制，其也可以通過(guò)誘導(dǎo)部分cccDNA的降解實(shí)現(xiàn)HBV cccDNA的清除[48-49]。但其應(yīng)用于臨床治療仍然存在很大的安全和技術(shù)問(wèn)題，包括如何避免脫靶效應(yīng)以及如何將基因編輯工具靶向遞送至感染肝細(xì)胞。此外，通過(guò)基因編輯工具使HBV cccDNA線性化后可能會(huì)導(dǎo)致HBV整合的概率增加；切割后的cccDNA往往會(huì)被宿主DNA修復(fù)機(jī)制修復(fù)后重新環(huán)化，由此可能會(huì)導(dǎo)致HBV cccDNA突變和耐藥[50]。

5 展望

近年來(lái)，新的高通量測(cè)序及篩選技術(shù)手段不斷涌現(xiàn)，可能為乙型肝炎治愈相關(guān)研究和實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化治療提供了新的技術(shù)手段和策略。全基因組篩選包括siRNA文庫(kù)、shRNA文庫(kù)以及CRISPR/Cas9文庫(kù)篩選技術(shù)作為高通量鑒定特定功能蛋白的有效工具，可用于HBV cccDNA靶向沉默或降解清除的宿主因子篩選。單細(xì)胞測(cè)序、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究病毒蛋白、核酸與宿主細(xì)胞之間相互作用關(guān)系，可能有利于揭示病毒感染建立關(guān)鍵介導(dǎo)因子及病毒與宿主細(xì)胞相互拮抗機(jī)制，為抗病毒治療提供新的靶點(diǎn)。其他技術(shù)手段包括多組學(xué)聯(lián)合分析臨床標(biāo)本隊(duì)列、以及結(jié)合傳統(tǒng)的“Pull-down”、ChIP及蛋白質(zhì)譜或基因測(cè)序技術(shù)鑒定特定蛋白-蛋白/DNA/RNA相互作用，可有利于尋找cccDNA特異性結(jié)合或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。體外生化系統(tǒng)的建立也有助于加深對(duì)cccDNA生物學(xué)特性的了解及相關(guān)宿主因子鑒定。高通量化合物篩選靶向病毒蛋白HBx、HBc或直接靶向cccDNA的分子可為抗病毒治療提供新的候選藥物及治療靶點(diǎn)。針對(duì)不同篩選策略構(gòu)建相應(yīng)的細(xì)胞模型是能否篩選成功的關(guān)鍵，例如可能需要相應(yīng)的帶有報(bào)告基因的重組cccDNA細(xì)胞模型；對(duì)HBV感染建立過(guò)程中病毒與宿主蛋白相互作用的研究，需要利用可支持HBV長(zhǎng)期、高效、穩(wěn)定感染的細(xì)胞模型如5C-PHH細(xì)胞模型；鑒定與cccDNA特異性結(jié)合或靶向調(diào)控的宿主因子，嘗試體外重構(gòu)并標(biāo)記cccDNA可能是較為合適的手段?？傊?，隨著對(duì)cccDNA生物學(xué)特性及轉(zhuǎn)錄和代謝調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐步加深，將為研發(fā)沉默清除cccDNA的新型抗病毒治療策略提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，以期最終實(shí)現(xiàn)乙型肝炎治愈。