劉小菊， 張 政

1國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心(深圳市第三人民醫(yī)院)， 廣東 深圳 518112；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 感染科， 廣州 510515

目前，全球約有2.57億慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病[1]。極少數(shù)的CHB患者可以通過抗病毒治療實現(xiàn)功能性治愈，即完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測不到、HBeAg轉陰、伴或不伴HBsAg血清學轉換，肝臟炎癥緩解和組織病理學改善，終末期肝病發(fā)生率顯著降低[2]。多數(shù)CHB患者需要進行長期甚至終身治療，這無疑給患者和衛(wèi)生系統(tǒng)帶來巨大挑戰(zhàn)。CHB患者實現(xiàn)功能性治愈代表患者獲得了持久的病毒學抑制和免疫學控制。長期應用一線抗病毒藥物如PEG-IFNα、核苷(酸)類似物(如替諾福韋或恩替卡韋)等可以實現(xiàn)病毒學抑制，但難以實現(xiàn)功能性治愈[3]。目前報道的抗病毒策略，包括病毒進入抑制劑、病毒衣殼釋放抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或治療性疫苗，都未能實現(xiàn)更多功能性治愈；其主要原因是肝細胞內(nèi)仍然殘留HBV cccDNA，且目前缺乏針對HBV cccDNA的特異性靶向藥物，完全消除HBV難以實現(xiàn)[4]。HBV建立慢性感染后，長期持續(xù)刺激宿主免疫細胞，肝臟微環(huán)境中特異淋巴細胞(CD8 T淋巴細胞和B淋巴細胞)功能被抑制甚至耗竭[5-7]。HBV清除取決于有效的適應性免疫應答，即HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞，發(fā)揮靶向抑制感染HBV的肝細胞和(或)病毒的效應。本文從特異性免疫細胞角度出發(fā)，對HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞耗竭及功能重建策略進行總結，為恢復或增強抗HBV適應性免疫提供線索，以實現(xiàn)對HBV的持續(xù)免疫學控制。

1 HBV特異性T淋巴細胞耗竭及功能重建

急性自限性HBV感染多表現(xiàn)為強烈的、多表位、多功能性的特異性T淋巴細胞反應；然而慢性感染中，HBV特異性T淋巴細胞反應較弱且功能不足[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，肝臟的環(huán)境特征，包括肝細胞和肝臟歸巢細胞的耐受性以及慢性HBV感染者肝內(nèi)富集的IL-10、TGFβ和精氨酸酶等，均對T淋巴細胞功能具有不良影響。CHB患者HBV特異性T淋巴細胞并非完全功能耗竭。在低病毒載量患者中，HBV特異性T淋巴細胞可表現(xiàn)出記憶樣表型，推測可能與接受較弱的HBV抗原持續(xù)刺激有關。PD-1等共抑制分子在調(diào)節(jié)T淋巴細胞效應作用以及T淋巴細胞衰竭中起著核心作用。HBV特異性T淋巴細胞上PD-1的表達，不僅取決于感染的階段，還取決于靶向的HBV表位。不同表位的HBV特異性CD8 T淋巴細胞在細胞分化、調(diào)節(jié)分子的表達和抗病毒功能上也有所不同。與核心抗原(HBV-core)特異性CD8 T淋巴細胞相比，聚合酶(HBV-pol)特異性CD8 T淋巴細胞則表現(xiàn)出更嚴重的耗竭狀態(tài)和更低的增殖能力。因此，不同感染階段不同表位特異性T淋巴細胞具有不同的表型和功能特征[11-12]。在設計和監(jiān)測HBV特異性T淋巴細胞反應時，必須考慮不同表位引起的潛在偏倚。而且不同表位HBV特異性T淋巴細胞具有不同的治療潛力，并且會對PD-1阻斷劑的免疫治療產(chǎn)生不同的應答。

記憶CD8 T淋巴細胞庫特異識別病毒后能夠大量擴增，并顯著抑制HBV[8]。逆轉耗竭T淋巴細胞功能，可恢復對CHB患者的保護性免疫。額外添加細胞因子可挽救耗竭T淋巴細胞功能。例如，轉錄因子T-bet調(diào)節(jié)效應CD8 T淋巴細胞中IFNγ和細胞毒性分子的產(chǎn)生，其表達可控制病毒慢性感染。病毒抗原和IL-2刺激誘導T-bet表達可以部分恢復功能受損CD8 T淋巴細胞的功能。IL-12也可增強對病毒的控制，聯(lián)合應用IL-12與阻斷PD-1途徑可進一步提高CD8 T淋巴細胞功能[13]。IL-21也具有促進HBV特異性CD8 T淋巴細胞的增殖能力[14]。

研究[15]還發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰性患者在停止核苷(酸)類似物治療后，HBV復發(fā)可能會改變特異性T淋巴細胞表型，并增強其體外對抗原的反應性；阻斷PD-L1可以進一步增強這些HBV特異性T淋巴細胞反應。例如，一項停藥研究[16]顯示，長期抗病毒治療的患者外周血HBV聚合酶/核心抗原特異性T淋巴細胞頻率逐漸增加，并與停藥后肝炎不復發(fā)相關；這也提示HBV特異性T淋巴細胞增高患者可以停止抗病毒治療，為臨床提供了一種潛在的免疫學標志。然而，與急性HBV感染者相比，長期治療患者HBV特異性T淋巴細胞的抗病毒能力仍不健全，還需要其他措施來挽救其功能損傷。研究[17]發(fā)現(xiàn)，識別HBV表位的PD-1hiT淋巴細胞顯著上調(diào)葡萄糖轉運蛋白Glut1，Glut1hiHBV特異性T淋巴細胞依賴于葡萄糖供應。因此，細胞的線粒體功能障礙大大限制了耗竭的HBV特異性T淋巴細胞的代謝可塑性；用線粒體靶向的抗氧化劑有望改善耗竭的HBV特異性CD8 T淋巴細胞抗病毒功能[5]。

2 HBV特異性B淋巴細胞耗竭及功能重建

表面抗體的產(chǎn)生標志著CHB功能性治愈，此時CHB患者體內(nèi)B淋巴細胞能夠分化為漿細胞，產(chǎn)生針對一系列HBV抗原的多克隆抗體。很多研究[18]已經(jīng)提示，B淋巴細胞在控制HBV感染中起著重要作用，但抗原特異性B淋巴細胞的檢測一直是個技術難題，阻礙了HBV特異性B淋巴細胞功能的研究。

近期研究[7]顯示，利用雙熒光染料偶聯(lián)病毒特異抗原的方法可檢測到外周及組織中特異性B淋巴細胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HBV表面抗原特異性B淋巴細胞在慢性HBV感染中持續(xù)存在，但與HBsAg滴度無顯著相關性。這種細胞也存在于乙型肝炎疫苗接種者和HBV感染恢復者體內(nèi)。利用高通量流式細胞分選技術可以從CHB患者中分離出HBsAg特異B淋巴細胞。體外實驗提示，CHB患者HBsAg特異性B淋巴細胞增殖能力降低，且在刺激后不能產(chǎn)生抗-HBs。但HBsAg轉陰患者，其HBsAg特異性B淋巴細胞卻能在刺激后產(chǎn)生抗-HBs，提示其功能損傷獲得恢復。進一步分析顯示，CHB患者HBsAg特異B淋巴細胞和總B淋巴細胞中經(jīng)典記憶性細胞亞群減少，而非經(jīng)典記憶B淋巴細胞增加。這種非經(jīng)典記憶B淋巴細胞主要特征是CD21和CD27低表達，但抑制性標志物PD-1和轉錄因子T-bet高表達；并且這類細胞在肝臟感染部位積聚，其抗病毒/炎癥細胞因子產(chǎn)生等能力以及分化成抗體生成細胞的能力均顯著降低。這種表型和功能障礙不僅局限于HBsAg特異性B淋巴細胞，還影響HBV感染者的整體B淋巴細胞群。阻斷PD-1或添加IL-2、IL-21和CD40配體可在體外部分恢復HBsAg特異性B淋巴細胞功能[6-7,19]。因此，B淋巴細胞功能障礙是HBV感染者不能產(chǎn)生抗-HBs的主要原因之一。然而，還有許多問題懸而未決。例如，導致HBsAg特異性B淋巴細胞功能障礙的細胞和分子機制還不清楚，機體B淋巴細胞亞群受損機制和臨床意義也不明確。未來研究應力圖尋找恢復HBsAg特異性B淋巴細胞功能的最佳策略。

利用雙熒光染料偶聯(lián)的HBcAg同樣可以檢測到HBcAg特異性B淋巴細胞。研究[20]發(fā)現(xiàn)，CHB患者體內(nèi)HBcAg特異性B淋巴細胞頻率高于HBsAg特異性B淋巴細胞。并且，與HBsAg特異性B淋巴細胞不同，HBcAg特異性B淋巴細胞在體外可以有效分化為抗體分泌細胞。在慢性HBV感染者中，血清抗HBcAg水平與HBcAg特異性B淋巴細胞的數(shù)量和功能顯著相關[20]。值得注意的是，HBcAg特異性B淋巴細胞除了產(chǎn)生抗-HBc外，可能還具有其他免疫調(diào)節(jié)作用。例如，抗-HBc可能會推動急性暴發(fā)性肝炎的發(fā)生發(fā)展；在肝臟中抗-HBc與HBcAg形成大顆粒抗原抗體復合物，可以激活經(jīng)典的補體途徑從而加重肝壞死[21]。因此，將來研究應進一步加強抗-HBc在CHB中的發(fā)病機理研究，以及HBcAg特異性B淋巴細胞抗體產(chǎn)生能力與功能性治愈的關系研究。

3 總結與展望

總之，從免疫學角度來看，實現(xiàn)CHB功能性治愈治療HBV慢性感染的首要目標應該是恢復患者HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞的數(shù)量和功能。將來免疫治療策略需要聯(lián)合應用抗病毒藥物，才能有效降低HBV抗原載量并恢復耗竭的抗HBV特異性免疫細胞功能。