黃潤(rùn)語 楊文悅 劉加強(qiáng)

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β），是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與眾多相關(guān)的信號(hào)通路［1］。在干細(xì)胞中，調(diào)控GSK-3β能影響神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育［2］、心肌缺血損傷［3］等重要生命進(jìn)程。GSK-3β也參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）的骨生成性能的調(diào)控，影響細(xì)胞成骨向分化、細(xì)胞歸巢和細(xì)胞增殖等重要環(huán)節(jié)。BMSC因具有低免疫源性、多向分化能力和較強(qiáng)的增殖能力，被認(rèn)為是骨組織工程技術(shù)中種子細(xì)胞的理想選擇。近年來，關(guān)于GSK-3β對(duì)BMSC骨生成性能的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究越來越多，以期為解決臨床問題提供新方法。故本文結(jié)合文獻(xiàn)就GSK-3β對(duì)BMSC生物學(xué)性能調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1.GSK-3β的性質(zhì)

GSK-3β為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）家族。GSK-3最早由于參與糖原代謝和胰島素信號(hào)通路而被廣泛研究，現(xiàn)今對(duì)于它的認(rèn)知更加完善，已知GSK-3參與糖原代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種生理過程［4］。在哺乳動(dòng)物中，GSK-3存在兩種同工型，GSK-3α與GSK-3β。它們的激酶結(jié)構(gòu)域高度同源，但在N端與C端存在差異［5］。目前對(duì)GSK-3α的研究較少，而GSK-3β因其在經(jīng)典Wnt通路、磷脂?；?-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt）通路和Notch通路等有關(guān)細(xì)胞增殖和分化的通路上而受到關(guān)注［6］。GSK-3β的底物數(shù)量龐大，對(duì)這些底物位于C端的氨基酸殘基進(jìn)行預(yù)磷酸化處理后GSK-3β才可識(shí)別它們［7］。

GSK-3β的活性主要取決于激活位點(diǎn)酪氨酸-216（Tyr-216）與失活位點(diǎn)色氨酸-9（Ser-9）之間磷酸化水平的平衡。在BMSC遷移過程中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）和細(xì)胞膜趨化因子受體4（C-X-C motif receptor 4，CXCR4）能夠通過PI3K/Akt信號(hào)通路使N端的Ser-9磷酸化從而失活GSK-3β，激活下游調(diào)控因子，促進(jìn)細(xì)胞遷移。此外，GSK-3β還存在其他的磷酸化位點(diǎn)能夠調(diào)控其自身活性，例如p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）磷酸化蘇氨酸-390（Thr-390）后，能使GSK-3β活性下降并激活靶基因Wnt。除磷酸化調(diào)控之外，GSK-3β的活性還受蛋白復(fù)合物結(jié)合、底物特異性、亞細(xì)胞定位以及蛋白酶切割等多種過程的影響［8］。

2.GSK-3β對(duì)BMSC生物學(xué)性能的調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 GSK-3β與 歸 巢GSK-3β所 在 的SDF-1/CXCR4/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路與自體BMSC歸巢有關(guān)［9，10］。BMSC表面高度表達(dá)的CXCR4，能與損傷或缺血的組織釋放的SDF-1結(jié)合，活化P13K/Akt信號(hào)通路而增加BMSC的遷移［11］?；罨腁kt能磷酸化GSK-3β，從而阻礙GSK-3β與β-catenin形成復(fù)合物，使得胞質(zhì)內(nèi)β-catenin含量增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增加和促進(jìn)細(xì)胞歸巢［12］。

抑制GSK-3β能明顯提升MSC的遷移能力。用氯化鋰直接降低細(xì)胞中GSK-3β活性，會(huì)引起基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達(dá)增多［13］。MMP-9能降解細(xì)胞外基質(zhì)而提升移動(dòng)性能［14］。Kim YS等學(xué)者的體外擴(kuò)增研究中發(fā)現(xiàn)，在GSK-3β下調(diào)時(shí)，Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子7（Rho guanine nucleotide exchange factor 7，ARHGEF7，又稱為β-PIX）和CXCR4增多，從而推測(cè)GSK-3β通過β-catenin/c-Raf/ERK/β-PIX通路參與hBM-MSC遷移［15］，而GSK-3β調(diào)控CXCR4/SDF-1軸的機(jī)制仍有待研究。在小鼠大腦中，敲減β-PIX的MSC的遷移水平明顯降低，顯示β-PIX會(huì)影響MSC遷移［16］。

在細(xì)胞缺乏GSK-3β時(shí)，細(xì)胞遷移會(huì)以低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α）依賴的方式進(jìn)行。在Flügel D等學(xué)者的研究中，GSK-3β-/-細(xì)胞在遷移水平上明顯高于GSK-3β+/+細(xì)胞。并且，由于轉(zhuǎn)染shRNA抑制HIF-1α后，GSK-3β-/-在遷移水平上的變化消失，可知細(xì)胞的遷移離不開HIF-1α的調(diào)控［17］。Udartseva OO等學(xué)者在低劑量光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）提升MSC的成血管潛能研究中，也證實(shí)了GSK-3β下調(diào)和MSC所分泌的多種不同的促血管生成因子增多（例如VEGF-A、MMP-9、IL-8、PAI-1等）以及MSC遷移能力提高的相關(guān)性［18］。

2.2 GSK-3β與增殖 在骨生成過程中，BMSC在微環(huán)境中的存活和增殖能力決定了修復(fù)速度和愈合效果。GSK-3β被鋰及其他特異抑制劑致失活后，BMSC增殖能力提高［19］。若使用β-catenin/T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（T cell transcription factor，TCF）通路抑制劑或小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制β-catenin，這種變化會(huì)消失。故GSK-3β依賴的經(jīng)典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路介導(dǎo)了MSC的增殖過程。在此通路中，失活的GSK-3β解除對(duì)β-catenin的抑制作用，β-catenin入核與TCF/淋巴增強(qiáng)因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF）結(jié)合，激活靶基因，例如c-Myc和cyclin D1，從而影響細(xì)胞增殖［20］。

c-Myc的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖緊密相連，在不同細(xì)胞中存在促增殖或抑增殖的雙重作用。Svitlana等人的研究證實(shí)了MSC中c-Myc的表達(dá)能夠提高細(xì)胞增殖水平［21］。其主要通過調(diào)控編碼細(xì)胞周期正向或負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白的靶基因而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。通過轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄使c-Myc強(qiáng)制表達(dá)后，靜止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；而c-Myc的下調(diào)或失活會(huì)使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻［22］。Gregory等人的研究也顯示了用鋰抑制GSK-3β的活性后，c-Myc的穩(wěn)定性增加，其在N端的Thr-58位點(diǎn)的磷酸化受抑，進(jìn)一步印證了GSK-3β對(duì)c-Myc水平的負(fù)向調(diào)控作用c-Myc的表達(dá)水平在胞內(nèi)受到精細(xì)調(diào)控，GSK-3β也參與其中［23］。靜息狀態(tài)下，c-Myc的Thr-58位點(diǎn)被GSK-3β磷酸化，促使c-Myc經(jīng)泛素途徑迅速蛋白酶解；而當(dāng)細(xì)胞受到絲裂原刺激后，c-Myc合成增加的同時(shí)，Ras被激活，經(jīng)Ras/Raf/MEK/ERK途徑，最終ERK介導(dǎo)c-Myc的Ser-62位點(diǎn)的磷酸化以使c-Myc在胞內(nèi)水平保持穩(wěn)定。此外，Ras激活后也能通過PI3K/Akt途徑抑制GSK-3β對(duì)Thr-58的磷酸化作用，c-Myc蛋白酶解減少，進(jìn)一步增加并穩(wěn)定其在胞內(nèi)的水平，從而發(fā)揮上述對(duì)細(xì)胞周期的推進(jìn)作用。

細(xì)胞受絲裂原刺激后，cyclin D1作為調(diào)節(jié)亞基與周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin dependent kinases 4/6，CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)Rb蛋白（retinoblastoma protein，Rb protein）磷酸化，最終釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，使細(xì)胞通過限制點(diǎn)進(jìn)入S期。GSK-3β被抑制劑致失活后，cyclin D1表達(dá)水平及S期細(xì)胞比例顯著增高［20］。GSK-3β一方面如上文所述在經(jīng)典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路中調(diào)控cyclin D1基因的表達(dá)，另一方面能夠直接磷酸化cyclin D1而使其降解。Diehl等人的研究顯示GSK-3β能夠特異性磷酸化cyclin D1的Thr-286位點(diǎn)，致使核輸出蛋白1（exportin 1，XPO1）介導(dǎo)cyclin D1出核而重新定位至胞質(zhì)，進(jìn)入蛋白酶解途徑。因此，細(xì)胞周期中cyclin D1的磷酸化與其亞細(xì)胞定位是通過GSK-3β聯(lián)系在一起的［24］。但與之相矛盾的是，也有研究顯示通過特異性抑制劑使GSK-3β失活后，cyclin D1在Thr-286的磷酸化水平未受影響［25］。由此，關(guān)于GSK-3β對(duì)cyclin D1的磷酸化作用目前尚無定論，有待進(jìn)一步研究。

2.3 GSK-3β與凋亡GSK-3β主要通過活化促凋亡轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)BMSC的凋亡。結(jié)合上文可以得出，在骨生成過程中，調(diào)節(jié)GSK-3β的活性水平能影響B(tài)MSC的數(shù)量和效能。

以Bcl-2蛋白中的促凋亡轉(zhuǎn)錄因子Bax為例，GSK-3β能夠通過直接磷酸化活化Bax，而當(dāng)Bax的被磷酸化區(qū)域發(fā)生突變，則不能完成線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，從而其構(gòu)象無法轉(zhuǎn)變至活化狀態(tài)［26］。

以促凋亡轉(zhuǎn)錄因子p53為例，有研究認(rèn)為GSK-3β對(duì)凋亡有促進(jìn)作用。其機(jī)制為GSK-3β能夠直接磷酸化p53的33位絲氨酸并介導(dǎo)p53的315和376位絲氨酸的磷酸化過程，并且除了這種直接作用，GSK-3β還能通過磷酸化p53特定的E3泛素連接酶MDM2以調(diào)節(jié)p53的水平，阻礙p53與MDM2的相互作用，從而抑制MDM2介導(dǎo)的泛素化，減少p53的蛋白酶解［27］，激活p53介導(dǎo)的凋亡途徑。但也有研究認(rèn)為GSK-3β能夠抑制p53的活化，對(duì)凋亡有抑制作用。其機(jī)制為GSK-3β能夠負(fù)反饋調(diào)控其下游的信號(hào)分子β-catenin，在GSK-3β水平較低時(shí)，β-catenin則會(huì)大量表達(dá)，由此通過阻斷MDM2依賴以及非MDM2依賴的細(xì)胞退行性變途徑來增加p53的基礎(chǔ)水平。但是高水平的GSK-3β則有相反作用［28］。

以上關(guān)于GSK-3β與p53對(duì)于凋亡作用的研究角度不同，得到的結(jié)果也不同。p53與GSK-3β之間的關(guān)系顯然還需要多角度的研究以獲得更深入、更全面的理解。

此外，在NF-κB信號(hào)途徑中，GSK-3β則是一種促生存激酶。研究發(fā)現(xiàn)，純合性缺失GSK-3β的小鼠由于促凋亡信號(hào)TNF而導(dǎo)致肝功能損傷，最終在E13.5之前死亡。這顯示了GSK-3β能夠抑制一種TNF依賴的細(xì)胞凋亡途徑［29］。

2.4 GSK-3β與成骨分化和成軟骨分化GSK-3β可通過多個(gè)途徑影響與骨生成相關(guān)的細(xì)胞的分化，如BMSC的成骨方向分化、成骨細(xì)胞系的成骨方向分化和BMSC的成軟骨方向分化等。前二者主要由Wnt/β-catenin通路調(diào)控，后者則涉及NF-κB信號(hào)通路。

抑制GSK-3β能促進(jìn)擁有成骨分化潛能和成脂分化潛能的間充質(zhì)祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞［30］。Wnt/β-catenin通路中，GSK-3β表達(dá)下調(diào)或GSK-3β磷酸化失活會(huì)使β-catenin因降解減少而濃度增加，穩(wěn)定的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因，促進(jìn)BMSC的成骨向分化。GSK-3β可弱化Runx2和Osterix的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控BMSC的成骨分化［31］。Runx2高表達(dá)于創(chuàng)傷愈合早期，能在早期促進(jìn)BMSC成骨分化，而在晚期抑制分化［32］；Osterix則是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在BMSC向成骨方向分化中起決定性作用。

此外，抑制GSK-3β還能促進(jìn)BMSC的成軟骨分化。有學(xué)者利用白介素-1β（IL-1β）刺激誘導(dǎo)炎癥環(huán)境，并采用氯化鋰抑制GSK-3β，研究此時(shí)BMSC的成軟骨分化情況，發(fā)現(xiàn)在GSK-3β信號(hào)受抑制的情況下，NF-κB蛋白的磷酸化水平和入核能力降低，從而抑制了NF-κB通路，進(jìn)而增強(qiáng)了BMSC在IL-1β誘導(dǎo)炎性環(huán)境下的成軟骨能力［33］。

3.小結(jié)

GSK-3β為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在BMSC的歸巢、增殖、凋亡和成骨向分化等環(huán)節(jié)中，為參與相關(guān)信號(hào)通路的重要蛋白，其所在的經(jīng)典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路是最關(guān)鍵的通路，可通過調(diào)控c-Myc、cyclin D1、Bax和p53影響細(xì)胞活性，而Runx2和Osterix等Wnt/β-catenin/TCF的靶基因，則可被GSK-3β弱化表達(dá)而影響成骨向分化。此外，結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)骨分化進(jìn)程的影響的研究，更多的在于GSK-3β對(duì)成骨細(xì)胞系的成骨方向分化和破骨細(xì)胞系的破骨細(xì)胞方向分化的影響。

總體上，負(fù)調(diào)控GSK-3β的活性水平，可促進(jìn)BMSC骨生成，這已在多項(xiàng)體內(nèi)、體外研究中通過鋰離子或特異抑制劑證實(shí)［34，35］。不過，在體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同病理狀態(tài)的嚙齒動(dòng)物模型，GSK-3β對(duì)骨生成的影響不一致［32］。一方面，說明了GSK-3β的活性變化及其效應(yīng)可能不夠穩(wěn)定和顯著。鑒于GSK-3β位于相互交聯(lián)的多個(gè)信號(hào)通路，上下游蛋白受其影響者眾多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為多方綜合的效果，需要更多精細(xì)設(shè)計(jì)的研究厘清。另一方面，這可能與各個(gè)研究使用的動(dòng)物種類、抑制劑種類、抑制時(shí)間長(zhǎng)短不同等因素有關(guān)。

在使用骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的過程中，支架上的種子細(xì)胞在進(jìn)行骨生成，為獲得更理想的修復(fù)效果，可通過誘導(dǎo)自體BMSC歸巢，增加缺損部位的細(xì)胞數(shù)量并增強(qiáng)修復(fù)功能［36］。在骨生成過程中，BMSC在微環(huán)境中的存活和增殖能力也決定了修復(fù)速度和愈合效果。通過負(fù)調(diào)控GSK-3β的活性水平，可影響B(tài)MSC這些重要性能，因此可作為促骨修復(fù)的策略參考之一。