鄒曉龍， 陳媛， 王艷， 王建濤

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）；2.生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川大學(xué)華西醫(yī)院肺癌中心 四川大學(xué)華西醫(yī)院放療中心，四川 成都（610041）

放療誘發(fā)的口腔黏膜炎（radiotherapy-induced oral mucositis，RTOM）和化療誘發(fā)的口腔黏膜炎（chemotherapy-induced oral mucositis，CTOM）嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，可導(dǎo)致患者疼痛、說話吞咽困難，以及局部和全身感染風(fēng)險(xiǎn)增高，甚至中斷治療進(jìn)而影響抗癌治療效果［1］。目前主要認(rèn)為放化療性口腔黏膜炎發(fā)病過程如下：最先涉及放療或化療對(duì)細(xì)胞的初始損傷，這種損傷可直接通過DNA 損傷或者產(chǎn)生活性氧物質(zhì)間接導(dǎo)致；隨后各種酶和轉(zhuǎn)錄因子的作用導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 等炎性細(xì)胞因子的上調(diào)，作用于黏膜下層和基底細(xì)胞上皮細(xì)胞；炎癥和組織損傷導(dǎo)致潰瘍和細(xì)菌定植，并進(jìn)一步加重炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的損傷；最后愈合階段由細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)出信號(hào)促使上皮細(xì)胞增殖，形成上皮以及重建黏膜屏障［2］。但目前關(guān)于口腔黏膜炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，對(duì)其治療也僅為對(duì)癥治療［3-4］。動(dòng)物模型作為生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的工具，在探究口腔黏膜炎的發(fā)病機(jī)制以及探索更好的防治方法中起到了至關(guān)重要的作用，本文就放化療性口腔黏膜炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展予以綜述，以期為相關(guān)研究提供動(dòng)物模型參考。

1 RTOM 動(dòng)物模型復(fù)制方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

目前國(guó)內(nèi)外多采用嚙齒類動(dòng)物來復(fù)制RTOM動(dòng)物模型，嚙齒動(dòng)物具有體型較小、飼養(yǎng)繁殖方便、遺傳背景清晰及品種品系多等優(yōu)勢(shì)，因此成為了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的首選。1983 年P(guān)arkins 等［5］首次選用近交系小鼠復(fù)制模型。目前文獻(xiàn)報(bào)道多采用8～14 周的近交系小鼠C3H［1，3，6-10］、Neu［1，3，6-9］、HeJ［10］、BALB/c［11-12］、C57Black/6［13-14］、BDF-1［15］等 復(fù) 制RTOM 動(dòng)物模型，小鼠動(dòng)物模型有著體型小，繁殖迅速，飼養(yǎng)相對(duì)廉價(jià)，壽命長(zhǎng)達(dá)2～3 年，與人類有許多生理和分子相似性，以及完全測(cè)序的基因組等優(yōu)勢(shì)，但是由于照射小鼠鼻部時(shí)大腦不可避免地也被照射，以及多次麻醉等原因經(jīng)常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡；也有研究者采用Sprague-Dawley 大鼠等復(fù)制模型［16-17］，和小鼠相比，大鼠體積較大，造模操作相對(duì)簡(jiǎn)便；少數(shù)研究者則選擇了金倉鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象［18］，嚴(yán)重的RTOM 在小鼠模型中誘導(dǎo)體重減輕和全身狀況惡化，而金倉鼠頰囊中產(chǎn)生的黏膜炎不影響食物攝入和體重，但是金倉鼠頰囊為免疫豁免區(qū)，因此不能提供準(zhǔn)確的免疫反應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單純X 射線照射誘導(dǎo)法 目前文獻(xiàn)報(bào)道的RTOM 動(dòng)物模型復(fù)制方法常采用X 射線設(shè)備照射。根據(jù)構(gòu)建動(dòng)物模型時(shí)X 射線照射部位分為局部照射和全身照射，根據(jù)照射方式分為單劑量照射和分割照射。Kowaliuk 等［6］采用雄性的C3H 及Neu 小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，投照劑量率為3 Gy/min，照射劑量為（11.8±1.4）Gy，對(duì)小鼠進(jìn)行單次照射，小鼠麻醉后仰臥于35 ℃預(yù)熱的鋁塊上，1 mm 厚的鋁板開出（3×3）mm2的小孔以確定照射區(qū)域，用鑷子將鼠舌拉過小孔并用膠帶固定，舌頭其他區(qū)域和身體用鉛屏蔽。此外，該小組還采用了經(jīng)小鼠鼻部分割照射的方法，將小鼠引導(dǎo)到有機(jī)玻璃管（內(nèi)徑28 mm）中，管前端用錐形管固定小鼠，關(guān)閉管后蓋防止小鼠逃逸，投照區(qū)域?yàn)轭^部，包括整個(gè)舌體，身體其他部位都被鉛有效保護(hù)，并控制每個(gè)小鼠鼻部照射區(qū)域之間的劑量差異在3%以內(nèi)，劑量率為1 Gy/min，照射劑量為3 Gy/次，1 次/d，每周5 次，持續(xù)照射1～2 周。有文獻(xiàn)提出僅對(duì)小鼠進(jìn)行1～2 周的分割照射并不會(huì)使RTOM 進(jìn)一步加重，這是由于從第二個(gè)治療周就逐漸開始抵消劑量，故在分割照射結(jié)束后可依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行類似于單劑量照射的額外補(bǔ)充照射［7］。Talwar 等［13］以8 周齡的C57Black/6 雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用特制的樹脂夾具在不麻醉小鼠的情況下固定動(dòng)物，137銫作為放射源，以劑量率2.35 Gy/min，8 Gy/d，持續(xù)5 d 對(duì)小鼠頭頸部進(jìn)行照射來誘發(fā)RTOM。Kim 等［16］使用雄性Sprague-Dawley 大鼠作為研究對(duì)象，使用特制固定裝置促進(jìn)大鼠頭部和頸部上方均勻的輻射分布，劑量率為2 Gy/min，總劑量18 Gy照射頸部區(qū)域。

1.2.2 X 射線照射聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)法 部分研究者在采用X 射線照射時(shí)輔助使用化療藥物來誘導(dǎo)模型，也取得了不錯(cuò)的效果。Wu 等［18］使用雄性LVG 金倉鼠為研究對(duì)象，在0～3 d，6～9 d 以6.5 Gy/d，總共給予52 Gy 的輻射劑量，并于第0 天和第6 天放射前2 h 腹腔注射兩次5 mg/kg 的順鉑，以此成功復(fù)制模型。Zhao 等［15］使用雄性BDF-1 小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先連續(xù)2 d 腹腔注射50 mg/kg 的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），然后進(jìn)行相對(duì)低劑量的全身照射（10 Gy）。此外，該小組還設(shè)計(jì)了一個(gè)具有嚴(yán)重口腔黏膜炎臨床特征，即舌頭潰瘍的動(dòng)物模型，以特制夾具固定小鼠并限制輻射區(qū)域?yàn)樾∈箢^頸部，照射方式選擇單劑量照射，劑量為30 Gy。這種方法死亡率低（＜10%），并可見明顯的舌頭潰瘍，潰瘍?cè)诘? 天左右發(fā)展到峰值。

多年來通過對(duì)RTOM 動(dòng)物模型的研究和完善，人們對(duì)于RTOM 有了一定的認(rèn)識(shí)，如各種照射條件下的ED50（誘發(fā)50%實(shí)驗(yàn)對(duì)象出現(xiàn)潰瘍體征的期望照射劑量），小鼠單劑量照射的ED50為（11.9 ± 1.0）Gy，分隔照射的1 周和2 周的ED50分別為（6.9 ±3.2）Gy 和（8.3 ± 2.1）Gy［7］。單劑量照射中潰瘍發(fā)生率、大小等具有顯著的劑量依賴性，18 Gy 照射時(shí)小鼠有100%存活率，但超過18 Gy 時(shí)小鼠的存活時(shí)間會(huì)因?yàn)闊o法糾正的體重減輕和脫水而無法超過10 d［11］。嚙齒類動(dòng)物對(duì)放射線的耐受程度顯著高于人類，這主要與上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖重組有關(guān)，對(duì)小鼠進(jìn)行分隔照射第二周開始，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)小鼠對(duì)放射線的耐受性增加。單劑量照射時(shí)照射劑量的選擇與所期望誘導(dǎo)的RTOM 嚴(yán)重程度有關(guān)，與臨床治療頭頸腫瘤無關(guān)，因?yàn)榕R床給予患者的劑量受到正常組織反應(yīng)的限制，所以分隔照射的建模方式更加貼近臨床，但是對(duì)于小鼠來說，分隔照射所需要的多次麻醉有可能導(dǎo)致小鼠的死亡率升高。除此之外，RTOM 模型還受到結(jié)構(gòu)體積等的限制，如與人類口腔結(jié)構(gòu)不同，照射過程影響其他重要器官，如放射性腦病等并發(fā)癥影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。

2 CTOM 動(dòng)物模型復(fù)制方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

不同種類的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型優(yōu)缺點(diǎn)與RTOM 動(dòng)物模型類似，目前文獻(xiàn)報(bào)道研究者在復(fù)制CTOM 動(dòng)物模型時(shí)多采用4～7 周的金倉鼠［19-26］，也有研究者采用6～10 周的小鼠ICR［27］、BALB/c［28］、BDF-1［15］等復(fù)制模型，少數(shù)研究者則選擇了Wistar 大鼠［29-30］、白化兔［31］等作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 單純化療藥物誘導(dǎo)法 5-FU 是一種抗癌藥物，通過特異性影響細(xì)胞周期S 期來發(fā)揮作用，5-FU 比其他非特異性影響細(xì)胞周期的藥物具有更強(qiáng)的毒性，毒性包括口腔黏膜炎或潰瘍，骨髓抑制等［32］，所以部分小組選擇僅以5-FU 來誘導(dǎo)口腔黏膜炎。Chang 等［28］采用6～8 周齡的雄性BALB/c 小鼠，在實(shí)驗(yàn)的第1、8、15、22、29 天依次以100 mg/kg的劑量對(duì)小鼠腹腔注射5-FU，然后在實(shí)驗(yàn)的第3、17、31、45 天將小鼠處死進(jìn)行組織學(xué)檢查。Zhao等［15］則通過向小鼠腹腔注射50 mg/kg 劑量的5-FU或者250 mg/kg 的CPT-11 來誘導(dǎo)CTOM。CTOM 動(dòng)物模型構(gòu)建的目標(biāo)是成本更低，比傳統(tǒng)模型更安全、更快速，以及產(chǎn)生明顯的潰瘍，以更好地估計(jì)藥物的效果。僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射5-FU，因小鼠口腔較小和缺乏頰囊而未行機(jī)械損傷誘導(dǎo)的小鼠模型在宏觀觀察時(shí)未觀察到出血、廣泛潰瘍和膿腫，主要以紅斑為主［28］，故基于5-FU 的CTOM 動(dòng)物模型還應(yīng)聯(lián)合其他刺激。

2.2.2 化療藥物聯(lián)合機(jī)械損傷誘導(dǎo)法 部分研究者在復(fù)制CTOM 動(dòng)物模型時(shí)選擇了一種注射5-FU聯(lián)合機(jī)械損傷的模式，機(jī)械損傷的目的是加強(qiáng)口腔黏膜炎和重現(xiàn)臨床癥狀［33-34］。Barbosa 等［19］使用150～200 g 的雄性金倉鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)的第1，2 天分別以60 mg/kg 和40 mg/kg 的劑量向倉鼠腹腔注射5-FU，第4 天在麻醉?xiàng)l件下用18 mm 針頭的尖端對(duì)倉鼠右側(cè)的頰囊進(jìn)行機(jī)械損傷。臨床和組織學(xué)評(píng)估均提示該模式誘導(dǎo)的黏膜炎與人類口腔黏膜炎類似，并遵循骨髓抑制程度的影響。

2.2.3 化療藥物聯(lián)合其他方式 以化療藥物聯(lián)合其他刺激如乙酸注射、紅外照射等也是部分研究小組在復(fù)制CTOM 動(dòng)物模型時(shí)采用的復(fù)制方法，均取得的不錯(cuò)的效果。Molina 等［24］采用8 周齡的雄性金倉鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在第0 天和第2 天以60 mg/kg 的劑量注射5-FU，第2 天和第3 天向右側(cè)頰黏膜注射30 μL 乙酸（10%），以5-FU 聯(lián)合乙酸的方法成功誘導(dǎo)了CTOM。Yoshino 等［23］報(bào)道了在倉鼠頰囊中用5-FU+乙酸處理比兩種藥物單獨(dú)處理可誘導(dǎo)更大的口腔黏膜炎區(qū)域，而且在實(shí)驗(yàn)期間與鹽水對(duì)照組相比倉鼠的重量幾乎沒有差異。5-FU聯(lián)合乙酸誘導(dǎo)的口腔黏膜炎動(dòng)物模型簡(jiǎn)單，便宜且廣泛適用，無需機(jī)械損傷也可產(chǎn)生明顯的潰瘍。Reda 等［31］則采用了1.7～2 kg 的白化兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，兔子禁食2 h后在麻醉下肌肉注射35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg 甲苯噻嗪。為了誘導(dǎo)黏膜潰瘍，50%乙酸浸泡的棉球按壓在兔口腔兩側(cè)頰黏膜組織60 s。Patel 等［29］通過使用化療劑和紅外輻射的組合在大鼠中成功誘導(dǎo)了口腔黏膜炎，小組選取了雌性14～16周齡，150～200 g的Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以白消安作為化療劑，6 mg/kg的劑量口服給藥4 d，大鼠舌頭于第1、4、10 天暴露在40 mV/cm2的紅外下輻射5 s。

3 動(dòng)物模型效果評(píng)估

3.1 大體樣本觀察法

大多數(shù)研究小組在進(jìn)行大體樣本觀察時(shí)選擇直接觀察法，這種方法簡(jiǎn)單方便，無需染色。部分研究組采用評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，即觀察出現(xiàn)紅斑、糜爛、血管擴(kuò)張、上皮潰瘍和膿腫等主要體征。一般多采用如下的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為正常黏膜，無糜爛和血管擴(kuò)張；1 分為紅斑，黏膜無糜爛；2 分為嚴(yán)重紅斑，血管擴(kuò)張和表面糜爛；3 分為一處或多處潰瘍形成，潰瘍總面積＜25%，嚴(yán)重紅斑和血管擴(kuò)張；4 分為頰囊表面潰瘍累積約50%；5 分為頰囊黏膜幾乎完全潰瘍，黏膜柔韌性喪失［21］。也有小組采用Parkins 等［5］之前開發(fā)的評(píng)分系統(tǒng)，即0 分為正常，0.5 分為輕度粉色，1 分為輕度紅色，2 分為重度紅色，3 分為局部剝脫，4 分為滲出覆蓋不到黏膜的50%，5 分為黏膜幾乎完全潰瘍［29］。Shimamura等［27］通過測(cè)量潰瘍的面積和自發(fā)恢復(fù)的時(shí)間來評(píng)估CTOM 模型。

3.2 甲苯胺藍(lán)染色法

部分研究小組為了更精確地確定潰瘍的范圍，采用甲苯胺藍(lán)染色法以使?jié)兛梢暬?，切除?shí)驗(yàn)動(dòng)物的舌頭用0.05%甲苯胺藍(lán)染色10 min，然后用10%乙酸漂洗1 min，成功染色后可見潰瘍?yōu)樯钏{(lán)色。通過測(cè)定染色區(qū)域和整個(gè)舌面區(qū)域的百分比可測(cè)量黏膜炎和潰瘍面積［10］。

3.3 組織病理學(xué)觀察法

在組織病理學(xué)上的評(píng)估也多采用評(píng)分的方式，將樣品固定在10%中性緩沖福爾馬林中，脫水并包埋在石蠟中，切片（5 μm）HE 染色后于光學(xué)顯微鏡（×40）觀察。以單盲方式確定炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，出血區(qū)域，水腫，潰瘍以及膿腫的存在。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0 分為正常上皮和結(jié)締組織；1分為不連續(xù)區(qū)域的血管擴(kuò)張或再上皮化，輕度炎癥浸潤(rùn)；2 分為中度血管擴(kuò)張，上皮組織變性，中性粒細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)，出現(xiàn)出血區(qū)域、水腫及潰瘍，但無膿腫；3 分為嚴(yán)重血管擴(kuò)張和中性粒細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)［19］。

4 小 結(jié)

一個(gè)好的口腔黏膜炎動(dòng)物模型應(yīng)該是與人類口腔黏膜炎具有相似性，形成率高，死亡率低，重復(fù)性好，病變易觀察，建模方法簡(jiǎn)便易行。本文中各種動(dòng)物模型復(fù)制方法均能成功復(fù)制口腔黏膜炎動(dòng)物模型且基本上滿足上述條件，但是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身體積過小，口腔黏膜組織與人類差異明顯等問題，放化療性口腔黏膜炎動(dòng)物模型需要有進(jìn)一步的更新和改進(jìn)。隨著新技術(shù)、新方法的提出，放化療性口腔黏膜炎動(dòng)物模型會(huì)成為研究口腔黏膜炎發(fā)病機(jī)制及防治手段的重要工具。