狄偉，吳然，文昌暉，唐挺，賈敏，孟夏

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng)；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng))

0 引言

土茯苓，根莖入藥，性平無(wú)毒，味甘、淡，歸肝、胃經(jīng)，《本草綱目》記載本藥具有“健脾胃，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，治拘攣骨痛，惡瘡癰腫......”?，F(xiàn)代研究表明[1]，土茯苓含有黃酮、鞣質(zhì)、生物堿等有效成分，具有抗炎、免疫抑制、抑菌抗菌、抗腫瘤等作用，廣泛應(yīng)用于治療皮膚科疾病，對(duì)銀屑病的治療有其獨(dú)特之處。然而，土茯苓中的藥物成份種類繁多，僅通過(guò)研究土茯苓中的單一成份物質(zhì)在銀屑病治療中的機(jī)制，只可說(shuō)明其部分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，很難完全闡明其全部的科學(xué)內(nèi)涵。

銀屑病，俗稱“牛皮癬”，相當(dāng)于古中醫(yī)“白疕”、“松皮癬”范疇，是一種自身免疫紊亂性皮膚病，受多基因調(diào)控和多環(huán)境要素影響，在我國(guó)的發(fā)病率約為0.47%[2]，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病的發(fā)病是遺傳和免疫共同作用的結(jié)果，涉及基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、細(xì)胞因子組學(xué)以及內(nèi)分泌免疫等多個(gè)環(huán)節(jié)[3-5]。除此之外，銀屑病的發(fā)生還受生活習(xí)慣、環(huán)境質(zhì)量以及外傷等多種因素的影響。因此，通過(guò)多路徑對(duì)銀屑病的治療進(jìn)行相關(guān)研究顯得尤為重要。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，是基于系統(tǒng)生物學(xué)和系統(tǒng)藥理學(xué)的研究理論，將藥物成分靶點(diǎn)與生物靶點(diǎn)形成互作網(wǎng)絡(luò)，從而更加全面、系統(tǒng)的研究藥物的機(jī)理[6]。本論文通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，歸納總結(jié)了土茯苓在銀屑病治療中的關(guān)鍵成分及靶點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)的方法進(jìn)行相關(guān)分析，深入探討了土茯苓關(guān)鍵藥物成分-靶點(diǎn)-通路之間的相互作用，為探索土茯苓治療銀屑病的機(jī)制提供新的思路。

1 方法

1.1 土茯苓成分收集與篩選

選定“土茯苓”中藥名為查詢關(guān)鍵詞，在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái) TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索土茯苓的所含的化學(xué)成分。以用口服生物利用度(oralbioavailability，OB) 和類藥性(drug-like，DL) 為關(guān)鍵指標(biāo)[7]，其中OB 值≥30%，是評(píng)價(jià)藥物能否發(fā)揮作用的重要指標(biāo)，DL 值≥0.18 代表藥物化學(xué)成分與已知化學(xué)藥的相似性，對(duì)確定中藥化學(xué)成分是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考意義[8]。

1.2 相關(guān)靶點(diǎn)信息的收集

以 Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/) 為工具，將篩選得到的土茯苓有效成分，進(jìn)行蛋白靶點(diǎn)的匹配，得到土茯苓有效成分結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，再以Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)為工具，查詢靶點(diǎn)蛋白相對(duì)應(yīng)的基因，并對(duì)其歸納、整理。在 TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://db.idrblab.org/ttd/)和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// www.omim.org/)中，檢索與銀屑病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和分析

將篩選得到的土茯苓有效化學(xué)成分與 Drugbank 中得到的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行總結(jié)整理，相關(guān)數(shù)據(jù)通過(guò) Cytoscape 3.6.0 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到土茯苓有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)基因整理，相關(guān)數(shù)據(jù)通過(guò) Cytoscape 3.6.0 軟件并使用Bisogenet 插件構(gòu)建疾病-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Cytoscape 3.6.0 中的 Merge 功能將前面2 個(gè)網(wǎng)絡(luò)合并，得到土茯苓在銀屑病的治療中，有可能發(fā)揮作用的靶點(diǎn)。通過(guò)MAS 3.0 系統(tǒng)將所得到的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)分類富集分析和KEGG 通路分析。GO 分類富集分析包括分子功能分析、生物學(xué)過(guò)程分析、細(xì)胞組分分析[9]。最后，通過(guò)以上分析，將土茯苓有效成分與靶點(diǎn)通路相對(duì)應(yīng)，形成有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓活性成分的篩選

以“土茯苓”為關(guān)鍵詞，通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共得到74 個(gè)化學(xué)成分，以口服生物利用度OB ≥30%和類藥性DL ≥0.18 為檢索條件，同時(shí)剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，最終得到15 個(gè)潛在的有效成分(見表1)。

表1 土茯苓潛在有效成分

2.2 靶點(diǎn)信息的收集和篩選

2.2.1 成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息的收集和篩選

圖1 土茯苓活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型

圖2 土茯苓治療銀屑病候選靶點(diǎn)的 GO 富集

圖3 土茯苓治療銀屑病 KEGG 通路富集

將收集得到的土茯苓 15 個(gè)潛在有效成分導(dǎo)入到Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中配對(duì)得到了 326 個(gè)蛋白，將所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白通過(guò) Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢其對(duì)應(yīng)的基因。在 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與銀屑病相關(guān)的基因，其中在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到 3202 個(gè)靶點(diǎn)，在 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到 12 個(gè)靶點(diǎn)，合并篩去重復(fù)靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0 軟件，運(yùn)用 Bisogenet 插件構(gòu)建疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將此網(wǎng)絡(luò)與土茯苓主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape 3.6.0 中的 Merge 功能相映射，取交集部分最終獲得56 個(gè)土茯苓治療土茯苓的靶點(diǎn)。將得到的56 個(gè)靶點(diǎn)制成靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖 1。從圖 1 中可看出這 56 個(gè)靶點(diǎn)間有相互作用，表明可能在某種層面上這些靶點(diǎn)是相互聯(lián)系的并通過(guò)多途徑、多方面的協(xié)調(diào)起到治療銀屑病的作用。

2.2.2 生物功能通路分析

為更進(jìn)一步探究其作用通路，將所得的56 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入到MAS 3.0 系統(tǒng)中進(jìn)行GO 分類富集分析(圖2)和KEGG 生物路徑分析(圖3)，列出分析結(jié)果排名前20 的路徑。其中GO分類富集分析包括分子功能分析、細(xì)胞組分分析、生物學(xué)過(guò)程分析，從圖2 中可以看出在分子功能層面上，土茯苓對(duì)蛋白質(zhì)異二聚活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等等影響較大；在細(xì)胞組分中，土茯苓對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等影響較大；在生物學(xué)過(guò)程中，土茯苓對(duì)酶激活、輔酶結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、氧化還原酶活性等影響較大。圖3 結(jié)果顯示，土茯苓治療銀屑病主要涉及的排名前20 的通路為PI3K-Akt 信號(hào)通路、蛋白聚糖信號(hào)通路、小分子核糖核酸通路、MAPK 信號(hào)通路等。

2.2.3 土茯苓活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型

將富集分析得到的排名前 20 的通路對(duì)應(yīng)土茯苓治療銀屑病的靶點(diǎn)及成分，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)模型。圖4 中紫色節(jié)點(diǎn)代表土茯苓中的活性成分，綠色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，圖5 柱狀圖可以直觀的看出排名靠前的靶點(diǎn)基因?yàn)椋篒L6、EGFR、VEGFA 為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，表明它們可能是土茯苓治療銀屑病的核心作用靶點(diǎn)。每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了土茯苓多成分、多靶點(diǎn)治療銀屑病的作用機(jī)制。同時(shí)多條通路之間是通過(guò)共有靶點(diǎn)連接而非獨(dú)立分開的，表明各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到治療銀屑病的作用。

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法法探討了土茯苓治療銀屑病的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該藥可能通對(duì)酶激活、輔酶結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、氧化還原酶活性等生物過(guò)程，并對(duì)蛋白質(zhì)異二聚活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等產(chǎn)生作用，其主要機(jī)制與PI3K-Akt 信號(hào)通路、蛋白聚糖信號(hào)通路、小分子核糖核酸通路、MAPK 信號(hào)通路等有關(guān)。

銀屑病的發(fā)病機(jī)制具體不詳，目前多認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及遺傳等都有一定的相關(guān)性。本研究共預(yù)測(cè)得到IL6、EGFR、VEGFA 等56 個(gè)土茯苓治療銀屑病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，IL-6 在炎癥以及B 細(xì)胞成熟的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，并具有多種生物學(xué)功能，其主要在急性或者慢性炎癥部位產(chǎn)生，在血清中分泌并通過(guò)IL-6 受體誘導(dǎo)表達(dá)，在B 細(xì)胞最終分化成免疫球蛋白發(fā)揮重要作用。Blauvelt[10]通過(guò)IL-17c 驅(qū)動(dòng)的IL-6 缺失小鼠模型，出現(xiàn)銀屑病樣皮損，證實(shí)了IL-6 參與了銀屑病發(fā)病。EGFR 是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，EGFR 與腫瘤細(xì)胞的高侵襲性、增殖、轉(zhuǎn)移關(guān)系、血管新生以及抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Tan F 等[11]研究了鹽酸伊考替尼對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及對(duì)銀屑病動(dòng)物模型的影響，證實(shí)了鹽酸伊考替尼通過(guò)阻斷EGFR 信號(hào)通路，達(dá)到治療銀屑病的目的。VEGFA 屬于PDGD/VEGF 生長(zhǎng)因子家族的一員，在血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮作用，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制凋亡并誘導(dǎo)血管通透性。Young HS 等[12]研究證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A (VEGFA)在銀屑病患者的皮膚病中表達(dá)增加，其中兩個(gè)VEGFA 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與早發(fā)性銀屑病相關(guān)(出現(xiàn)于40 歲之前)。

圖4 土茯苓治療銀屑病的靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 茯苓活性成分-靶點(diǎn)-通路柱狀圖

綜上所述，本文通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討了土茯苓治療銀屑病的可能作用機(jī)理，闡述了土茯苓多藥物成分-多作用靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為進(jìn)一步系統(tǒng)地開展土茯苓治療銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。