簡 迅， 徐 瑩， 劉 平， 慕永平

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所， 上海 201203

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路，其病理特征為肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)的形成。無論任何病因，慢性肝病進(jìn)展到肝纖維化，均涉及肝實(shí)質(zhì)的慢性損傷、持續(xù)的炎癥反應(yīng)、纖維化的持續(xù)進(jìn)展和創(chuàng)傷愈合反應(yīng)[1]。因此，如何改善肝臟病理微環(huán)境，即抑制肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝祖細(xì)胞向有利于肝功能修復(fù)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化，成為肝纖維化治療研究的熱點(diǎn)。本文重點(diǎn)就巨噬細(xì)胞和內(nèi)源性肝祖細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生和修復(fù)過程中的作用，以及兩者之間的“對話”機(jī)制進(jìn)行概述。

1 肝臟巨噬細(xì)胞的起源及其在肝纖維化發(fā)生與修復(fù)中的作用

巨噬細(xì)胞起源于單核細(xì)胞前體，是廣泛分布的吞噬性天然免疫細(xì)胞，具有吞噬、抗原提呈和活性分泌等多種功能，在組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和宿主防御中發(fā)揮重要作用[2]。巨噬細(xì)胞一旦定位于肝臟，即表現(xiàn)出較高的吞噬活性，以清除門靜脈來源的內(nèi)毒素和有害物質(zhì)[3]。肝臟巨噬細(xì)胞根據(jù)其來源可分為肝臟固有的巨噬細(xì)胞(Kupffer cell，KC)和循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞[4-5]。KC來源于卵黃囊和胎肝單核細(xì)胞，其表型特征為：F4/80hi、CD11blo、CD169+、CD68+、Mac-2+和CD80lo/-[6-8]。 其主要功能是清除血液中的微生物和細(xì)胞碎片，清除老化的紅細(xì)胞，確保肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[9-10]。 循環(huán)中單核細(xì)胞的表型特征為：F4/80int、CD11bhi和CD80hi，其主要功能是免疫監(jiān)測[8]。當(dāng)肝損傷時，KC可最早發(fā)現(xiàn)損傷并啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，通過分泌趨化因子CC基序配體(CC-motif ligand 2, CCL2)，募集外周淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，位點(diǎn)C(lymphocyte antigen 6 complex, locus C, Ly6C)+單核細(xì)胞大量浸潤[11]，Ly6C+單核細(xì)胞可分泌多種炎性細(xì)胞因子如TNF α、IL-1β、IL- 6、IL-12/23(P40)等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12]。此外，Ly6Chi單核巨噬細(xì)胞還可分泌TGFβ1和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)-BB，介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[13]，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[14]。同時，脾臟內(nèi)的Ly6Clow單核細(xì)胞被募集進(jìn)入肝臟后，可促進(jìn)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)-2/-9/-12/-13等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)損傷肝組織的修復(fù)[15]。因此，肝臟巨噬細(xì)胞在肝損傷的不同階段或修復(fù)反應(yīng)中被激活，發(fā)揮促炎、促纖維化或促進(jìn)創(chuàng)傷愈合/修復(fù)等作用[16]，提示調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)對肝纖維化的修復(fù)具有重要的臨床意義。

2 巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)決定肝纖維化進(jìn)展或修復(fù)

巨噬細(xì)胞是組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的精密傳感器，具有高度的可塑性，可根據(jù)環(huán)境信號快速地在促炎(M1巨噬細(xì)胞)和抗炎(M2巨噬細(xì)胞)之間進(jìn)行表型轉(zhuǎn)換，稱之為巨噬細(xì)胞極化，M1和M2巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜、細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞因子等方面均具有高度異質(zhì)性，對纖維化肝臟中的ECM的沉積和組織重建發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)作用[17-18]。

巨噬細(xì)胞極化過程由復(fù)雜的分子機(jī)制調(diào)控，目前認(rèn)為干擾素調(diào)節(jié)因子/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子/細(xì)胞因子信號抑制劑家族(interferon regulatory factor/signal transducer and activator of transcription/suppressor of cytokine signaling, IRF-STAT-SOCS)是其關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。簡而言之，INFγ和Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)激活STAT1，促進(jìn)M1極化，同時上調(diào)SOCS3，抑制M2極化；IRF5和IRF8通過Notch信號通路促進(jìn)M1極化。IL-4和IL-13激活STAT6，促進(jìn)M2極化，同時上調(diào)SOCS1，抑制M1極化；IL-10和IL-3分別激活STAT3和STAT5，促進(jìn)M2極化[19]。在來自細(xì)菌的脂多糖(LPS)或損傷、炎癥產(chǎn)生的細(xì)胞因子等信號的影響下，巨噬細(xì)胞經(jīng)歷經(jīng)典活化并分化為M1巨噬細(xì)胞，其特征是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如TNFα、IL-6以及活性氧等，它們的細(xì)胞毒性使得M1巨噬細(xì)胞在清除病原體的同時引發(fā)炎癥反應(yīng)，盡管這種反應(yīng)對宿主具有保護(hù)作用，但持續(xù)的炎癥反應(yīng)對宿主極為不利。為了保護(hù)宿主免受這種炎癥損害，巨噬細(xì)胞可被IL-4和IL-13替代激活并分化為M2巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生IL-10等抗炎細(xì)胞因子，參與凋亡細(xì)胞的吞噬、炎癥消退、血管生成、組織修復(fù)與重塑等[20-21]。提示巨噬細(xì)胞極化在組織穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)生、炎癥及其消退中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22]。研究[23]表明部分肝切除后，采用脂質(zhì)體包裹的二氯亞甲基二磷酸鹽(Cl2MDP)選擇性耗竭KC，既可阻斷肝臟IL-6、IL-10和TNFα mRNA的合成，也可降低HGF和TGF β1 mRNA表達(dá)，延緩肝再生。最新研究表明KC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Nogo-B蛋白可促進(jìn)M1極化，促進(jìn)酒精性肝病進(jìn)展；Nogo-B缺失則可促進(jìn)M2極化，促進(jìn)酒精性肝病的恢復(fù)。提示KC與肝再生和損傷修復(fù)的關(guān)系極為密切[24]。

此外，目前認(rèn)為M2型巨噬細(xì)胞可分為3個亞群：M2a、M2b和M2c[25]。M2a由IL-4或IL-13激活，在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，如通過高表達(dá)的IL-10和低表達(dá)TNFα、IL-12引起免疫抑制；通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體促進(jìn)HSC凋亡；通過MMP-2促進(jìn)膠原降解等途徑促進(jìn)ECM的降解和組織重塑[25-26]。M2b由Fcg受體、TLR或IL-1R誘導(dǎo)分化，是肝臟常駐的巨噬細(xì)胞類型，在正常肝臟中表達(dá)IL-1β，通過免疫復(fù)合物提高IL-1、IL-10和TNFα表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并驅(qū)動Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)[27]。M2c由IL-10誘導(dǎo)分化，在纖維化形成過程中，通過高表達(dá)TGFβ1和PDGF促進(jìn)HSC活化增殖與膠原合成，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，并通過高表達(dá)MMP-2/-9/-12/-13降解正常ECM[26-27]。也有研究[28]認(rèn)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以稱作M2d巨噬細(xì)胞，主要通過促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。以上研究提示，調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對于肝損傷的修復(fù)具有重要的臨床意義。

3 Wnt信號介導(dǎo)纖維化肝臟巨噬細(xì)胞與肝祖細(xì)胞相互作用

近年來，再生醫(yī)學(xué)在難治性疾病領(lǐng)域彰顯出明顯優(yōu)勢，理論上，基于干細(xì)胞移植的再生醫(yī)學(xué)擁有光明前景，但由于其安全性、成本、副作用以及體內(nèi)生存能力等問題而受限。因此，近年來，干細(xì)胞移植的替代治療策略受到廣泛關(guān)注，該策略主張充分發(fā)揮內(nèi)源性干細(xì)胞的功能，即通過調(diào)整干細(xì)胞的微環(huán)境，使內(nèi)源性干細(xì)胞增殖并分化為組織修復(fù)所需的細(xì)胞類型，從而避免活檢、體外細(xì)胞擴(kuò)增和移植等復(fù)雜過程[29]。在肝臟中，未分化但具有干細(xì)胞功能的細(xì)胞群體被稱為內(nèi)源性肝祖細(xì)胞(以下簡稱為肝祖細(xì)胞)，具有分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞的潛能，其分化方向取決于所處的微環(huán)境，與巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)和Wnt信號通路活化尤為密切。

Wnt信號通路在組織再生與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，其配體Wnts蛋白(Wnt1～11等)主要來源于巨噬細(xì)胞[30]。Saha等[31]研究表明，來源于巨噬細(xì)胞胞外囊泡包裹的Wnts可保護(hù)腸道干細(xì)胞，提高放射損傷后腸道干細(xì)胞的生存率，而Porcupine(PORCN)在Wnt核心配體分泌機(jī)制中不可或缺，采用PORCN抑制劑Wnt-C59消除巨噬細(xì)胞的Wnts分泌功能后，其對腸道干細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，為Wnts來源于巨噬細(xì)胞提供了直接證據(jù)。近年來，作為干細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分，巨噬細(xì)胞在肝再生領(lǐng)域受到普遍關(guān)注[32]。

在肝纖維化進(jìn)展期，肝祖細(xì)胞可向肌成纖維細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化，發(fā)揮促纖維化作用。一方面，在肝纖維化進(jìn)展期，由M1巨噬細(xì)胞釋放TNFα等激活肝祖細(xì)胞的非經(jīng)典Wnt信號通路(如Wnt5/frizzled2)，促進(jìn)肝祖細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[33]。在此過程中，巨噬細(xì)胞通過吞噬壞死的肝細(xì)胞或分泌CCL2/3募集CCR2+Ly6Chigh的炎性單核細(xì)胞浸潤，分泌腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducible factor of apoptosis, Tweak)，Tweak與其受體Fn14相互作用，促進(jìn)肝祖細(xì)胞進(jìn)一步增殖[34]。Liu等[35]研究表明，對二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌模型注射外源性肝祖細(xì)胞后，可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，可能與LPS/TLR4信號通路介導(dǎo)肝祖細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。筆者前期研究結(jié)果表明，在2-乙酰氨基芴(2-AAF)/CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，肝祖細(xì)胞可向肌成纖維細(xì)胞分化，發(fā)揮促纖維化作用；體外研究表明阻斷Wnt信號通路可阻斷肝祖細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[33]。另一方面，在肝纖維化進(jìn)展期，伴隨肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和功能的衰減，出現(xiàn)以門靜脈周圍肝祖細(xì)胞活化為特征的“膽管反應(yīng)”，目前已證實(shí)新生的膽管上皮細(xì)胞可分泌TNFα、TGFβ、PDGF、IL-1、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子-1等多種促纖維化細(xì)胞因子，促進(jìn)門靜脈周圍的成纖維細(xì)胞和HSC活化為肌成纖維細(xì)胞，合成大量的ECM，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[36]。此外，損傷的肝細(xì)胞還可通過分泌危險相關(guān)分子模式激活祖細(xì)胞壁龕內(nèi)的HSC[37]。活化的肝祖細(xì)胞還可反過來通過CCL2和CX(3)CL1等趨化因子，激活巨噬細(xì)胞分泌Tweak、調(diào)節(jié)激活正常T淋巴細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞間黏附分子等途徑誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[38]。

在肝纖維化恢復(fù)期，肝祖細(xì)胞主要向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化。目前已證實(shí)肝祖細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化過程主要由經(jīng)典的Wnt/β-Catenin信號通路調(diào)控，其機(jī)制可能與M2巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的肝細(xì)胞碎片后釋放Wnt3A，激活肝祖細(xì)胞經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號通路，促進(jìn)其向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化有關(guān)[39]，且Wnt3A還可促進(jìn)IL-4或TGFβ1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2極化[40]。臨床研究[41]表明，在兒童非酒精性脂肪性肝病，促炎巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，二十二碳六烯酸治療可使巨噬細(xì)胞極化為抗炎表型并上調(diào)Wnt3A表達(dá)，促進(jìn)肝祖細(xì)胞β-Catenin磷酸化并使其向肝細(xì)胞分化。以上研究提示W(wǎng)nt信號介導(dǎo)了肝臟巨噬細(xì)胞與肝祖細(xì)胞間的“對話”，基于巨噬細(xì)胞極化或Wnt信號通路的調(diào)控研究有可能成為抗肝纖維化治療的新途徑。

4 小結(jié)

綜上所述，巨噬細(xì)胞和肝祖細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞M1極化可分泌IL-6、IL-1、TGFβ、PDGF等，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)和HSC活化；并可通過釋放TNFα等激活肝祖細(xì)胞非經(jīng)典Wnt信號通路，促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞分化。而在肝纖維化恢復(fù)期，巨噬細(xì)胞M2極化可激活肝祖細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號通路，誘導(dǎo)向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)肝纖維化修復(fù)。因此，近年來，改善肝損傷或纖維化的治療研究主要集中在肝巨噬細(xì)胞，這些干預(yù)措施主要通過調(diào)節(jié)KC的活化、炎性單核細(xì)胞遷移、巨噬細(xì)胞極化和分化等發(fā)揮作用[15]。但許多研究只是在器官層面進(jìn)行免疫功能分析，并沒有明確肝臟巨噬細(xì)胞的表型。也有學(xué)者[42]認(rèn)為肝纖維化恢復(fù)期的Ly6C+單核細(xì)胞具有與M1/M2不同的表型，甚至認(rèn)為M1/M2定義在很大程度上不適用于肝病。因此，目前對于肝臟巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的潛在機(jī)制還缺乏充分的認(rèn)識，未來需要對肝巨噬細(xì)胞的基因組和表型進(jìn)行深入的研究，并進(jìn)一步明確其調(diào)控肝祖細(xì)胞分化的機(jī)制，為肝纖維化的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。