王邦，谷峰

CRISPR-Cas9對人類線粒體基因組微同源區(qū)切割后產(chǎn)生新生變異

王邦，谷峰

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點實驗室，溫州 325027

線粒體是真核細胞的一種細胞器，其含有線粒體基因組(mtDNA,mitochondrial DNA)，是細胞能量制造、多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及重要代謝物合成的中心。人類mtDNA長約16.6 kb，編碼13個呼吸鏈所必需的蛋白以及24個蛋白翻譯必需的RNA。人類mtDNA的突變會導(dǎo)致很多種重大疾病，比如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥、心血管疾病等[1]。因此，線粒體相關(guān)疾病是人類重大疾病的重要組成部分。細胞由于有氧呼吸作用產(chǎn)生的氧自由基簇(reactive oxygen species, ROS)，無時無刻不在損傷mtDNA，進而誘發(fā)mtDNA突變。目前利用靶向突變mtDNA的核酸酶(如mito-ZFNs/TALENs, mitochondria-targeted zinc fingernucleases/transcription activator-like effector nucleases)可以有效去除帶有突變的線粒體。這在線粒體疾病臨床治療方面具有重要應(yīng)用前景[2~4]。這個過程具體包括：利用mito-ZFNs/TALENs切割突變的mtDNA，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，由此導(dǎo)致突變的mtDNA降解，這樣達到去除致病mtDNA的目的。例如，Carlos T. Moraes團隊利用AAV9進行在體遞送mito-TALENs到線粒體，其可特異性切割含有突變m.5024C>T (tRNA基因)的小鼠mtDNA，實現(xiàn)了在肌肉和心臟細胞線粒體中tRNA表達量的恢復(fù)[3]，有望能治療該突變導(dǎo)致的心臟疾病。與此類似，另一個相似工作，同樣是修復(fù)能導(dǎo)致心臟疾病的突變m.5024C>T，只是使用了mito-ZFNs[4]。說明多種核酸酶均可以在哺乳動物線粒體中發(fā)揮活性切割。而在水稻和油菜中，利用特異性切割mtDNA上胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因和，實現(xiàn)了以同源重組方式對mtDNA進行編輯，恢復(fù)了雄性可育性[5]。同樣在TALE (transcription activator-like effector)基礎(chǔ)上，融合來自于新洋蔥伯克霍爾德菌()的毒素蛋白——胞嘧啶核苷脫氨酶DddA (double-stranded DNA deaminase toxin A)，使DddA能在TALE的引導(dǎo)下靶向人類mtDNA，催化胞嘧啶堿基(C)轉(zhuǎn)換為尿嘧啶(U)，并在其后mtDNA復(fù)制中轉(zhuǎn)為胸腺嘧啶(T)，從而實現(xiàn)mtDNA的定點堿基轉(zhuǎn)換[6]。

然而曝露在ROS的人類mtDNA不僅有堿基官能團的損傷，還有雙鏈斷裂的損傷。在產(chǎn)生雙鏈斷裂后，除了目前被領(lǐng)域廣泛認(rèn)可的mtDNA丟失以外，切割后的mtDNA是否能夠以某種方式留在細胞中，目前仍然不清楚。該問題是線粒體生物學(xué)中一個非常重要的基礎(chǔ)科學(xué)問題，因為該問題關(guān)系到線粒體基因組到底有沒有DNA修復(fù)。如果有，是如何修復(fù)的？同時，該問題的回答也具有重要臨床意義，因為其關(guān)系到以基因組編輯為基礎(chǔ)的線粒體臨床治療可能存在潛在的副作用。

針對上述問題，本團隊利用線粒體靶向的信號肽融合了來自金黃色葡球菌()的Cas9 (mito-SaCas9)[7]，測試了多個mtDNA位點，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)有些位點會產(chǎn)生小片段缺失或插入(圖1)。進一步的分析發(fā)現(xiàn)這些序列具有一定的序列特異性，即具有微同源序列(5~25 bp)的區(qū)域在經(jīng)過切割后可以形成突變。隨后通過限制性內(nèi)切酶將突變的序列進行富集，利用一代測序能夠檢測到缺失或插入突變。且由此導(dǎo)致的mtDNA突變隨著細胞分裂，可以穩(wěn)定地遺傳給子代細胞。但是，利用只能對DNA雙鏈中產(chǎn)生缺口的缺口酶Cas9 (Cas9 nickase)進行作用，結(jié)果顯示不能使mtDNA產(chǎn)生突變，這些結(jié)果提示突變是由于線粒體中雙鏈斷裂修復(fù)途徑誘發(fā)所導(dǎo)致(圖1)。

如何進一步提高突變的發(fā)生率呢？通過聯(lián)合多重單向?qū)NA (single guide RNA, sgRNA)以及使用雙鏈斷裂修復(fù)的小分子抑制劑，可以顯著提高突變的發(fā)生率(0.01%~0.03%)，顯示mtDNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中，突變發(fā)生的可塑性。此項工作為線粒體基因組DNA修復(fù)機制提供了新的認(rèn)識，并對目前利用基因編輯技術(shù)治療線粒體遺傳病具有重要參考價值。需要指出的是，本研究中mtDNA突變的效率遠低于前文所提及的DddA介導(dǎo)的單堿基編輯效率[6]，表明在線粒體中mtDNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)的修復(fù)活性不如堿基切除修復(fù)。未來開發(fā)高效、簡便的mtDNA編輯工具仍然是線粒體基因編輯的重要研究內(nèi)容。該工作于2020年11月26日提前在線發(fā)表在(http://engine.scichina.com/doi/ 10.1007/s11427-020-1819-8)。溫州醫(yī)科大學(xué)王邦博士為該論文第一作者，谷峰研究員為論文通訊作者。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃和浙江省自然科學(xué)基金資助。

圖1 線粒體基因組微同源區(qū)域雙鏈斷裂誘發(fā)的新生突變

線粒體基因組微同源區(qū)域(由5~25 bp直接重復(fù)序列構(gòu)成，圖中紅色標(biāo)記片段)在mito-CRISPR/Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂后，大部分會走入線粒體降解途徑；少量在線粒體基因組雙鏈斷裂修復(fù)機制的作用下，被修復(fù)，同時可能產(chǎn)生缺失或插入的新生突變。

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