練志全,鄧 銘,孫寶麗,柳廣斌,郭勇慶,劉德武,李耀坤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

母羊的繁殖力直接關(guān)系到養(yǎng)羊生產(chǎn)的效益，應(yīng)用生物技術(shù)對羊?qū)嵭性缙谌焉镌\斷，可以在母羊懷孕早期階段快速地檢測出母羊是否懷孕，從而對母羊進(jìn)行分群精心管理和對空懷母羊進(jìn)行及時(shí)補(bǔ)配，同時(shí)也是提高母羊繁殖效率，促進(jìn)集約化管理，提高養(yǎng)殖效益的重要技術(shù)措施。因此，對母羊進(jìn)行早期妊娠診斷在現(xiàn)代養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)中具有重要意義。

1 妊娠診斷

1.1 陰道檢查法

陰道檢查法主要是使用內(nèi)窺鏡觀察陰道粘膜顏色、粘液稀薄程度和子宮頸口的變化進(jìn)行妊娠診斷。當(dāng)使用內(nèi)窺鏡觀察母羊陰道粘膜時(shí)，空懷母羊的陰道粘膜始終為粉紅色；若母羊懷孕，一段時(shí)間后粘膜會由粉紅色變?yōu)樯n白色；此外，懷孕母羊的陰道粘液量較少，呈透明狀且比較粘稠，而未懷孕母羊的粘液量很多，顏色灰白且較為稀?。蝗焉锬秆虻淖訉m頸緊閉，子宮頸口處會出現(xiàn)漿糊狀的粘塊，形成“粘液栓”。此法檢查發(fā)情配種后60 d的母羊，妊娠確診率可達(dá)95%，但由于診斷時(shí)間較晚且操作需要一定經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，此方法的應(yīng)用也受到了限制。

1.2 腹腔檢查法

腹腔檢查法是使用腹腔鏡檢測懷孕母羊的子宮和妊娠黃體來判斷其否懷孕的獨(dú)特方法，一般母羊配種后17 d即可用此方法診斷，診斷準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上。但需要在無菌條件下對母羊局部或全身麻醉，對手術(shù)羊有一定損傷，且腹腔鏡設(shè)備較為昂貴，不滿足我國畜牧行業(yè)生產(chǎn)的需求。

1.3 免疫測定法

1.3.1 乳膠凝集抑制實(shí)驗(yàn)診斷法 此法主要是是根據(jù)乳汁中含有的孕酮量來對配種后的母羊進(jìn)行早期妊娠診斷。母羊妊娠的判定標(biāo)準(zhǔn)為：若出現(xiàn)均勻一致的凝集顆粒為陰性(未妊娠)，不出現(xiàn)凝集顆粒為陽性(妊娠)。但此法操作困難，且價(jià)格昂貴，在生產(chǎn)上使用較少[1]。

1.3.2 放射免疫測定法(RIA) RIA法是將放射性同位素的靈敏性和抗原-抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來測定體液中的生殖激素的超微量分析法，是20世紀(jì)70年代國外開始建立起來的家畜早期妊娠診斷技術(shù)[2]，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、取樣少、測定樣品多。李永鵬[3]以8.3 ng/mL的孕酮值為判定界限，即孕酮值小于8.3 ng/mL判為空懷，采用放射免疫測定法(RIA)對配種后22至25 d的薩能奶山羊的妊娠診斷準(zhǔn)確率為96.5%(109/113)，未妊娠母羊準(zhǔn)確率為90%(9/10)。許欣[4]在已配湖羊群體中設(shè)定孕酮含量大于1.7 ng/mL為妊娠，低于1.5 ng/mL為未妊娠，介于兩者之間為疑似懷孕，以此為標(biāo)準(zhǔn)用RIA法進(jìn)行妊娠診斷，妊娠確診率達(dá)到了100%，未妊娠確診率為82.61%，疑似妊娠確診率為64%。雖然RIA法的準(zhǔn)確性高，妊娠診斷速度快，但設(shè)備昂貴，對操作人員技術(shù)水平有一定要求，以及耗時(shí)和存在放射性危害等，使其應(yīng)用受限。

1.3.3 酶免疫測定法(EIA) EIA是以抗原與抗體結(jié)合為基礎(chǔ)，以酶促反應(yīng)為檢測信號，將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶高效催化反應(yīng)的靈敏性結(jié)合起來的超微量技術(shù)[5]。通過測定母畜乳汁中孕酮或血清中硫酸雌酮的含量，從而判斷母畜是否懷孕。由于酶免疫測定具有特異、簡便、靈敏和快速等特點(diǎn)，自20世紀(jì)70年代創(chuàng)立以來已在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域及臨床的診療中有了廣泛的應(yīng)用。Boscos等[6]用EIA法對配種后19 d的母羊進(jìn)行妊娠診斷，設(shè)定血清中孕酮含量高于2.5 ng/mL為懷孕，診斷的總體準(zhǔn)確率為91.4%(117/128)。與放射免疫測定(RIA)技術(shù)相比，此法操作更加簡單、方便和準(zhǔn)確性高，但操作過程較為費(fèi)時(shí)。

EIA酶免疫測定里還有常用的一種方法，即酶聯(lián)免疫吸附法，也稱為ELISA法。自1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann發(fā)展了用固相免疫分析法檢測體液中微量物質(zhì)的免疫學(xué)技術(shù)，ELISA現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷等各方面得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。有研究采用ELISA法檢測綿羊血清中的抗孕酮抗體因子對母羊妊娠診斷，結(jié)果表明妊娠綿羊中該因子的水平顯著低于空懷羊(配種妊娠和空懷的準(zhǔn)確率分別為87.5%和84.3%)[9]。Ganaie等[10]用ELISA試劑盒對50頭配種后15～30 d的母羊進(jìn)行早期妊娠診斷，準(zhǔn)確率達(dá)到了98%。通過對ELISA法檢測的優(yōu)化，現(xiàn)已建立了ELISA試劑盒的檢測方法，但試劑盒的價(jià)格較為昂貴且需一定的保存條件，故未在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。

1.3.4 早孕因子(EPF)診斷法 早孕因子EPF是一種免疫抑制因子，存在于早期妊娠母體的血清中。Morton等[10]首次發(fā)現(xiàn)EPF對妊娠具有高度的特異性，可作為早期妊娠診斷的生化標(biāo)志之一。從受精開始到妊娠中期，EPF在人類及家畜母體內(nèi)起著重要的作用，同時(shí)會出現(xiàn)生物活性的變化，因此也可以用來預(yù)測胚胎的死亡和流產(chǎn)，目前EPF的研究是生殖免疫學(xué)研究的一個熱點(diǎn)。研究表明，綿羊交配后24 h即可在母體檢測出EPF，幾乎在綿羊的整個孕期都可檢測到其存在。張慧茹等[11]研究發(fā)現(xiàn)妊娠山羊血清的RIT值顯著高于空懷山羊，且在第1天和第8天出現(xiàn)了2個峰值(18.8±1.1/21.2±1.8)。張興會等[12]在絨山羊配種后22～30h就能夠檢測出早孕因子活性，且懷孕羊和未懷孕羊血清的玫瑰花環(huán)抑制滴度差異顯著。

1.3.5 其它免疫診斷法 膠體金免疫層析法作為一種新的免疫學(xué)方法，因其使用方便、檢測迅速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來該方法得到了迅速發(fā)展，在羊的妊娠檢查中也有相應(yīng)的應(yīng)用。許欣等[4]對27頭湖羊用膠體金層析試紙條進(jìn)行妊娠檢測，妊娠確診率為83.3%，未妊娠準(zhǔn)確率為66.7%。早孕診斷試紙條的檢測方法對母畜和胎兒均無損害，且與放射免疫測定法(RIA)，酶免疫測定法(EIA)和乳膠凝集測定法等相比操作更為簡便。另外，這種試紙可在室溫下儲存、運(yùn)輸方便及其價(jià)格低廉，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和推廣價(jià)值。

血清酸滴定法的原理是在室溫條件下，將受檢母畜血清與適當(dāng)濃度的HCL充分混合后，用一定摩爾濃度的硝酸滴定至適當(dāng)pH時(shí)，再將溶液靜置，在透射光下觀察，根據(jù)反應(yīng)顏色變化來進(jìn)行妊娠診斷[13]。王應(yīng)安等[14]采用血清酸滴定法對綿羊進(jìn)行早孕診斷，妊娠、未妊娠確診率分別為89.6%和90.9%。王海錄等[15]用血清酸滴定法對小尾寒羊進(jìn)行妊娠診斷，對妊娠羊的確診率為89.72%，未妊娠羊的確診率為91.18%。鄭毛亮等[16]對人工授精配種后的綿羊采用了血清酸滴定法進(jìn)行了早期診斷，妊娠羊的診斷準(zhǔn)確率可達(dá)89.88%，未孕準(zhǔn)確率為96.83%。由于血清酸滴定法診斷的時(shí)間早、方法簡便和結(jié)果準(zhǔn)確，可用于實(shí)際中母羊的早期妊娠診斷，極具實(shí)用性和推廣價(jià)值。

1.4 超聲波檢測

應(yīng)用超聲波對動物妊娠診斷就是利用超聲波的物理特性，與動物組織結(jié)構(gòu)的聲學(xué)特性結(jié)合的一種物理診斷方法[17]。自Lindahl[18]1966年將超聲診斷技術(shù)引入獸醫(yī)領(lǐng)域以來，超聲波診斷技術(shù)就在獸醫(yī)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，目前診斷儀主要有三種：A超、B超和多普勒超聲[19]。A型超聲波儀是一種價(jià)格低廉，體積小、攜帶方便的妊娠診斷儀，但因診斷時(shí)易出現(xiàn)假陰性的情況，近年來在妊娠診斷中使用的越來越少[20]；多普勒超聲診斷準(zhǔn)確率高，但對操作者技術(shù)要求較高，在生產(chǎn)上并未得到廣泛應(yīng)用；應(yīng)用B型超聲診斷儀(B超)是目前妊娠診斷最實(shí)用的方法，尤其適用于規(guī)?；驁鯷21]。

目前A型超聲波儀的在生產(chǎn)中應(yīng)用較少，B型超聲診斷儀(B超)在妊娠診斷中的應(yīng)用較為普遍。古麗莎拉等[22]運(yùn)用A型超聲診斷儀對配種后45～60d的632只綿、山羊進(jìn)行早期妊娠診斷，準(zhǔn)確率達(dá)到了93.7%。Ganaie等[10]用A型超聲診斷儀和多普勒超聲對配種后31～45 d母羊群體進(jìn)行早期妊娠診斷，妊娠確診率均為56%。Jones等[23]用B型超聲診斷儀對發(fā)情配種后33～45 d母羊進(jìn)行妊娠診斷，準(zhǔn)確度可達(dá)90%以上，且診斷準(zhǔn)確率隨妊娠天數(shù)的增加而上升。Amber[24]對配種后19 d的母羊進(jìn)行妊娠診斷，懷孕母羊妊娠準(zhǔn)確率為95.5%(105/110)，未妊娠確診率為100%(5/5)。刁顯輝等[25]對發(fā)情配種后35 d的母羊用B型超聲診斷儀進(jìn)行妊娠診斷，準(zhǔn)確率將近100%。楊冬梅等[26]用配有7.5MHz探頭的B型超聲診斷儀對310只經(jīng)胚胎移植的受體山羊進(jìn)行早期妊娠診斷，胚胎移植后60～65 d試驗(yàn)?zāi)秆蛉焉镌\斷陰性(B超判斷未懷孕)的準(zhǔn)確率為98.1%，妊娠診斷陽性(B超判斷懷孕)準(zhǔn)確率為100%。武和平等[27]對1820只胚胎移植后33～80 d的受體山羊進(jìn)行B超妊娠診斷，妊娠羊診斷準(zhǔn)確率為99.92%(1210/1211)，未妊娠羊診斷準(zhǔn)確率為99.39%(605/609)。李福剛等[28]應(yīng)用B型超聲診斷儀對279只波爾山羊胚胎移植受體白山羊和87只自然交配波爾山羊進(jìn)行早期妊娠檢查，在胚胎移植后20～100 d試驗(yàn)羊妊娠診斷陰性(B超判斷未懷孕)的準(zhǔn)確率為100%，正常交配羊妊娠診斷陽性(B超判斷懷孕)的準(zhǔn)確率為100%。在生產(chǎn)中使用B型超聲診斷儀對發(fā)情配種后21 d母羊的妊娠準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上，且檢測方法簡單、快速，值得大力推廣應(yīng)用[29]。

總之，考慮到現(xiàn)場操作條件及技術(shù)成本，目前現(xiàn)有的妊娠診斷技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)。雖然B超的診斷時(shí)間較晚，但目前仍是較為實(shí)用一種診斷方法。

2 產(chǎn)羔數(shù)預(yù)測

國外已有研究表明，妊娠期母羊的腹圍、體重和外陰子宮頸距離等體尺指標(biāo)的變化與產(chǎn)羔數(shù)量有關(guān)。山羊妊娠期腹圍的變化較為明顯，尤其是山羊懷孕晚期腹部的擴(kuò)張程度。根據(jù)腹圍、體重等體尺指標(biāo)預(yù)測山羊產(chǎn)羔數(shù)的方法簡單、可靠，安全廉價(jià)，不需要特殊設(shè)備或經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員；隨著這個技術(shù)的不斷發(fā)展完善，該方法可用于準(zhǔn)確預(yù)測母羊的產(chǎn)羔數(shù)，在羊場生產(chǎn)中可進(jìn)行推廣應(yīng)用[30]。在反芻動物中，妊娠期母畜的飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)補(bǔ)充量非常重要，因而在山羊的妊娠期檢測胎兒的數(shù)量對妊娠后期的維持及胎兒發(fā)育具有重要意義[31]。Mellado等[30]研究表明，山羊妊娠的第68～90天體重的變化是最有效的識別妊娠期母羊懷有單胎或者雙胎的方法，根據(jù)此方法預(yù)測母羊產(chǎn)雙羔的準(zhǔn)確率為62%。

雖然尚無研究表明生殖激素的濃度與產(chǎn)羔數(shù)成比例關(guān)系，但許多研究都發(fā)現(xiàn)孕酮和雌激素的含量可能與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)，且產(chǎn)羔數(shù)量越多，妊娠期間母羊體內(nèi)的雌激素和孕酮水平會越高。Termeulen等[32]的研究表明懷有多胎山羊的雌激素和孕酮水平顯著高于懷有單胎的母羊，這可能與激素刺激胎盤的發(fā)育有關(guān)。Manalu等[33]的研究顯示妊娠8～20周時(shí)，懷有多胎的母羊血清孕酮水平顯著高于單胎母羊，而懷有雙胎和三胎胎兒的母羊血清孕酮水平無顯著差異，懷有多胎母羊在此期間的血清孕酮增加濃度顯著高于單胎母羊。Gür等[34]、Swanson等[35]的研究結(jié)果表明，懷有雙胎母羊血清中的雌激素和孕酮水平都顯著高于單胎母羊。

3 小 結(jié)

及時(shí)準(zhǔn)確的妊娠診斷，尤其是早期妊娠診斷是提高母羊生產(chǎn)效率和生產(chǎn)效益的技術(shù)保證。同時(shí)，確診妊娠的母羊，提前預(yù)測其產(chǎn)羔數(shù)量，根照其胎兒數(shù)與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合理的飼養(yǎng)和管理，確保妊娠母羊的營養(yǎng)需要和促進(jìn)胎兒的生長發(fā)育；對未妊娠母羊應(yīng)盡快查明原因，進(jìn)行發(fā)情處理或及時(shí)淘汰，避免母羊長期處于假妊娠或乏情狀態(tài)，有效提高母羊的繁殖效率，增加養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)收益。