羅凱，黎謝夢丹，董靜，王倩

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院/廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣東廣州510095

肺癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的83%[1]。表皮生長因子受體(EGFR)突變型NSCLC是肺癌的一種重要分子亞型。研究[2]表明，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療EGFR突變型NSCLC可獲得良好的療效，然而其原發(fā)和繼發(fā)耐藥不可避免，且機制仍未完全闡明，其中吉非替尼是最經典的一代EGFR-TKI類藥物，現在臨床應用廣泛[3]。異質性是惡性腫瘤的一個重要特征，其整體表現為同一腫瘤內部或不同病灶間腫瘤細胞的差異性[4]。多項研究[5]表明，腫瘤的異質性與藥物治療的反應性密切相關，然而EGFR突變型NSCLC的異質性特征及其動態(tài)演化規(guī)律與EGFR-TKI治療反應性的關系尚未完全闡明，且缺少相關實驗依據，值得進一步研究。2018年3月5日～2019年12月20日，本研究觀察了NSCLC細胞株HCC827的克隆異質性，并分析其與吉非替尼藥物敏感性的關系，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 HCC827細胞株購自中科院上海細胞所；胎牛血清與1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；吉非替尼購自selleck公司；lipo2000購自Thermo公司；EGFR基因突變檢測試劑盒購自北京鑫諾美迪公司；MET、HER2基因擴增檢測試劑盒購自廈門艾德公司；MTS、細胞基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司；pEGFP-N1與pDsRed1-N1質粒為本實驗室保存。流式細胞儀購自BD公司；一代基因測序儀購自Thermo公司；熒光顯微鏡購自徠卡公司；多功能酶標儀購自BioTek公司。

1.2 單克隆化子代細胞的獲取及分組 取對數生長期HCC827細胞，胰酶消化并過濾后獲得單細胞懸液，利用極限稀釋法將極低濃度細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，顯微鏡下確認各培養(yǎng)孔的細胞數量，篩選僅存在單個細胞的培養(yǎng)孔，持續(xù)培養(yǎng)3周后將96孔培養(yǎng)板中的單克隆化HCC827細胞轉移至6孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，并最終獲得單克隆化HCC827子代細胞株12株，隨機選擇其中6株單克隆化子代HCC827細胞進行后續(xù)實驗，分為A、B、C、D、E、F組。另取對數生長期HCC827細胞，記為親代細胞組。各組胞均利用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)，待細胞融合度70%～80%時進行相關實驗。

1.3 各組細胞增殖能力異質性觀察 ①各組細胞平板克隆形成數觀察。采用平板克隆形成實驗。取各組細胞，按每孔500個細胞的數量將細胞接種至6孔培養(yǎng)板上，每個細胞設置3個平行培養(yǎng)孔，3 d換培養(yǎng)液一次，連續(xù)培養(yǎng)10 d后棄去培養(yǎng)液，70%預冷乙醇固定后，結晶紫染色，純水洗滌后晾干培養(yǎng)板，計數各組細胞平板克隆形成數。②各組細胞增殖倍數觀察。采用細胞生長曲線實驗。取200 μL濃度5×103個/毫升的對數生長期各組細胞接種至6塊96孔細胞培養(yǎng)板中，每組細胞在每塊培養(yǎng)板中設置5個重復培養(yǎng)孔，待細胞貼壁后分別在0、24、48、72、96、120 h時取一塊培養(yǎng)板，在培養(yǎng)板的各個細胞培養(yǎng)孔中分別加入20 μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后測定各培養(yǎng)孔的吸光度值，以0 h的吸光度值為基數，計算各組培養(yǎng)24、48、72、96、120 h時的細胞增殖倍數。

1.4 各組細胞對吉非替尼敏感異質性觀察 采用細胞藥敏實驗。取各組細胞，按每孔2 000個接種至96孔培養(yǎng)板中，每組細胞設置無藥物空白對照孔和8個濃度梯度藥物孔，待細胞貼壁后，8個濃度梯度藥物孔分別加入2.00×104、1.00×104、5.00×103、2.50×103、1.25×103、625、312.50、156.25 μmol/L的吉非替尼，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后測吸光度值，利用emuch IC50軟件計算各組細胞的IC50值，以IC50值表示各組細胞對吉非替尼敏感性，并篩選對吉非替尼最敏感和最耐藥的細胞組。

1.5 各組細胞遺傳異質性觀察 ①各組細胞EGFR基因檢測。采用Sanger直接測序法。利用基因組DNA提取試劑盒提取各組細胞DNA后，依據EGFR基因突變檢測試劑盒說明書步驟PCR擴增細胞EGFR基因第18～21外顯子，利用蝦堿性磷酸酶復合物消化PCR擴增產物后行二次測序擴增反應，再利用醋酸鈉法對測序擴增產物進行純化，將純化后的測序擴增產物上機測序，待獲得樣品EGFR基因第18～21外顯子序列信息后，將之與標準序列進行比對以獲得基因突變檢測結果。②各組細胞MET、HER2基因檢測。采用熒光原位雜交實驗。依據MET、HER2基因擴增檢測試劑盒說明書步驟，制備細胞滴片后，先用蛋白酶處理細胞滴片，再煮沸變性，隨后滴加探針雜交過夜，次日DAPI復染后，熒光顯微鏡下觀察結果。MET基因擴增結果判讀標準：計數30個細胞，觀察細胞內紅色信號點總數、綠色信號點總數，計算Ratio值(Ratio值=細胞內紅色信號點總數/細胞內綠色信號點總數)；當Ratio值≥1.8或MET信號連接成簇，判斷為陽性結果，其余為陰性結果。HER2基因擴增結果判讀標準：計數30個細胞，計算Ratio值和HER2信號數(HER2信號數=紅色信號點總數/30)；當Ratio值≥2.0或HER2信號數≥6.0時為陽性，當Ratio值<2.0或HER2信號數<4.0時為陰性，當Ratio值<2.0且HER2信號數在4～6之間時，增加計數20個細胞后重新判讀結果。

1.6 吉非替尼對細胞異質性的動態(tài)影響觀察 采用細胞克隆混合實驗。利用lipo 2000將pEGFP-N1空載質粒(綠色熒光)、pDsRed1-N1空載質粒(紅色熒光)分別轉染對本研究中對吉非替尼最敏感、最耐藥的細胞組，取親代細胞組，將三組細胞分別進行等比例混合培養(yǎng)，記為敏感+耐藥克隆組、敏感+親代細胞組、耐藥+親代細胞組，各組細胞于熒光顯微鏡下拍攝細胞熒光狀態(tài)后，加入1.5 μmol/L吉非替尼處理，并設置加入空白溶劑的空白對照組，分別記為敏感+耐藥克隆對照組、敏感+親代細胞對照組、耐藥+親代細胞對照組，連續(xù)培養(yǎng)兩周，其間換液后細胞繼續(xù)加藥處理，兩周后再于熒光顯微鏡下拍攝細胞熒光狀態(tài)，比較各組熒光標記細胞的比例變化規(guī)律。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 ①各組細胞平板克隆形成數比較。親代細胞組與A～F組的平板克隆形成數分別為(190.00±2.83)、(171.00±10.21)、(210.00±8.59)、(203.00±5.33)、(158.00±7.46)、(174.00±6.89)和(187.00±12.07)個，其中B組克隆形成數高于親代細胞組(P<0.01),A、D和E組克隆形成數低于親代細胞組(P均<0.05)。②各組細胞增殖倍數比較。各組細胞增殖倍數比較見表1。由表1可知，B、F組細胞培養(yǎng)48、72、96、120 h時的增殖倍數與親代細胞組相比，P均<0.05;C、D組細胞培養(yǎng)72、96、120 h時的增殖倍數與親代細胞組相比,P均<0.05;提示親代細胞與各子克隆細胞間存在明顯的增殖能力異質性，其中B組細胞增殖倍數最高，D組細胞增殖倍數最低。

表1 不同時間點各組細胞增殖倍數比較

2.2 各組細胞對吉非替尼敏感性比較 親代細胞組與A～F組細胞對吉非替尼的IC50值分別為(1.00±0.04)、(1.61±0.21)、(1.38±0.29)、(3.77±0.35)、(20.57±0.39)、(6.47±0.52)、(1.91±0.13)μmol/L，其中B組細胞對吉非替尼的IC50值與親代細胞組相比，P>0.05，表明B組細胞為對吉非替尼最敏感的細胞組；其余各組細胞對吉非替尼的IC50值與親代細胞組相比，P均<0.05，其中D組細胞IC50值最高，表明D組細胞為對吉非替尼最耐藥的細胞組。

2.3 各組細胞遺傳異質性比較 EGFR基因突變檢測結果顯示，親代細胞組與A～F組細胞均為EGFR基因19 Del突變。熒光原位雜交實驗結果顯示，D組細胞HER2基因擴增為陽性(Ratio值為2.04)、MET基因擴增為陰性，而親代細胞組和A、B、C、E、F組細胞HER2基因和MET基因擴增均為陰性，表明親代細胞組與D組細胞在遺傳背景上存在異質性。

2.4 吉非替尼對細胞異質性的動態(tài)影響比較 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現，敏感+耐藥克隆對照組細胞混合培養(yǎng)后，敏感細胞比例占優(yōu)，而敏感+耐藥克隆組細胞混合培養(yǎng)后基本僅余耐藥細胞，敏感細胞零星可見；敏感+親代細胞對照組混合培養(yǎng)后，敏感細胞比例基本未變，而敏感+親代細胞組細胞混合培養(yǎng)后，殘留細胞明顯減少，且殘留細胞中親代細胞比例高；耐藥+親代細胞對照組混合培養(yǎng)后，耐藥細胞比例下降，而耐藥+親代細胞組細胞混合培養(yǎng)后，殘留細胞明顯增多，且殘留細胞中耐藥細胞比例高。

3 討論

以EGFR為靶點的EGFR-TKIs藥物治療正式開啟了NSCLC的靶向治療新歷程，截至目前EGFR-TKIs類靶向藥物已發(fā)展了三代并均獲批進入臨床應用，而第四代EGFR-TKIs類靶向藥物現正在研制當中[3]。EGFR-TKIs靶向治療在使EGFR突變型NSCLC患者取得臨床獲益的同時，EGFR-TKIs靶向耐藥卻也如影相隨，大多數患者在接受EGFR-TKIs靶向治療12個月左右均不可避免出現繼發(fā)耐藥[6]。吉非替尼與厄洛替尼是一代EGFR-TKIs的代表性藥物，阿法替尼是二代EGFR-TKIs的代表性藥物，當NSCLC患者接受一代或二代EGFR-TKIs治療后，約60%患者出現EGFR基因的二次T790M突變，而該突變導致EGFR蛋白變構，變構的EGFR蛋白與一代或二代EGFR-TKIs的結合力下降導致繼發(fā)耐藥[7]。三代EGFR-TKIs類藥物奧希替尼針對合并T790M突變的NSCLC患者開發(fā)，其不僅可用于常規(guī)EGFR突變型NSCLC患者的靶向治療，還可用于出現二次T790M突變的一代或二代靶向治療耐藥NSCLC患者的后續(xù)治療[8]。四代EGFR-TKIs則是針對三代常見C797S耐藥突變開發(fā)的新一代EGFR-TKIs[9]。研究[7]顯示，EGFR-TKIs耐藥機制可分為四個大類：EGFR基因二次突變、下游分子異常激活、旁路活化和組織細胞表型轉變。同時部分EGFR突變型NSCLC患者在EGFR-TKIs靶向治療前就表現為原發(fā)耐藥，已報道原發(fā)耐藥機制與繼發(fā)耐藥機制類同，如HER2擴增和c-MET擴增就既與原發(fā)耐藥相關又與繼發(fā)耐藥相關[10-11]。而EGFR-TKIs靶向治療耐藥的復雜性也從側面體現了NSCLC的高度異質性。

腫瘤的異質性是惡性實體瘤的一種重要特征，在細胞層面可表現為不同腫瘤細胞間的遺傳異質性和表型異質性，在整體層面異質性又可表現為空間異質性和時間異質性，也即病灶不同部位或不同病灶間的差異性和不同病程中腫瘤的差異性[4]。近來隨著單細胞測序技術的發(fā)展和應用，人們認識到腫瘤是由時空動態(tài)變化著的各種亞克隆細胞組成的混合物，在不同腫瘤微環(huán)境的篩選作用下，不同亞克隆細胞呈現陽性趨同進化趨勢[12]。GERLINGER等[13]報道，在4例腎癌患者治療前后的原發(fā)灶和轉移灶中，通過多點取樣行基因檢測發(fā)現，不同取樣位點的突變基因譜存在明顯差異，同時針對不同取樣位點進行獨立測序可構建腫瘤的進化分支。NICHOLAS等[14]利用代表性寡核苷酸分析技術對手術切除的腫瘤組織不同部位進行了基因拷貝數分析，發(fā)現腫瘤組織的不同部位其基因拷貝數存在明顯的異質性，并呈現出一定的進化相關性。本研究首先從細胞表型上分析了人NSCLC細胞株HCC827的異質性，發(fā)現在增殖表型上不同子克隆細胞具有明顯的異質性，同時不同子克隆細胞對吉非替尼的藥物反應性也存在明顯的異質性，其中D號克隆耐藥指數超過親代細胞20倍。在遺傳異質性方面，本研究發(fā)現親代HCC827細胞和各子代細胞均存在EGFR基因的19 Del突變，此外D號克隆還存在額外的HER2基因擴增，提示各子克隆細胞存在共同的克隆起源，但不同細胞克隆間已出現了遺傳背景演進，以上研究結果為NSCLC腫瘤異質性的存在提供了直接的實驗證據。

腫瘤的異質性還與腫瘤的治療抵抗相關。SHI等[15]檢測了6例存在EGFR基因激活突變并對EGFR-TKI敏感NSCLC患者EGFR-TKIs治療前以及最終耐藥后的腫瘤組織樣本，發(fā)現部分患者在靶向治療前的原發(fā)病灶中就已經存在了EGFR基因突變型和野生型兩種細胞，而在部分靶向治療耐藥后的腫瘤組織樣本中已檢測不到治療前檢測到的EGFR基因突變。本研究首次發(fā)現，在EGFR-TKI敏感的HCC827細胞中存在HER2基因擴增的原發(fā)吉非替尼耐藥子克隆細胞(D號克隆)并獲得了相應細胞株。理論上，當耐藥細胞與敏感細胞混合培養(yǎng)時，給予藥物作用后應優(yōu)選出耐藥細胞。在本研究中，將增殖能力強且對EGFR-TKI敏感的B號克隆細胞與增殖能力較弱且耐藥的D號克隆細胞混合培養(yǎng)后，增殖能力強的B號克隆細胞逐漸轉變?yōu)閮?yōu)勢克隆；對混合培養(yǎng)細胞給予吉非替尼藥物壓力后，D號克隆細胞卻逐漸轉變?yōu)榻^對優(yōu)勢克隆細胞，與理論推測相符。然而表型檢測實驗結果顯示，HCC827細胞中存在多個對吉非替尼不同程度耐藥的細胞克隆且其增殖能力各不相同，同時細胞克隆混合實驗顯示將B號克隆和D號克隆分別與親代HCC827細胞等量混合培養(yǎng)后，在吉非替尼藥物壓力下，兩組中均有無熒光標記細胞殘留，其中D號克隆加HCC827細胞組殘留細胞中無熒光標記的HCC827細胞比例與D號克隆接近，提示HCC827細胞中還存在著其他耐藥細胞克隆。前期實驗[16]結果顯示，在利用低濃度吉非替尼長時間誘導HCC827細胞獲得繼發(fā)耐藥HCC827/AR細胞后，遺傳背景檢測未見HCC827/AR細胞存在HER2基因擴增。我們分析認為，其一，HCC827細胞中還存在著其他耐藥細胞克隆又或在長期培養(yǎng)過程中演化出了其他的EGFR-TKI耐藥子克??；其二，在吉非替尼藥物壓力下，D號耐藥克隆可取代增殖能力更強的敏感克隆成為相對優(yōu)勢克隆，但在耐藥子克隆集合中增殖能力更強的一個或多個子克隆可能成為最終的優(yōu)勢克?。黄淙?，不同的藥物濃度和藥物作用時間可能會對腫瘤細胞的異質性造成不同的篩選效應。本研究結果提示NSCLC存在復雜的腫瘤異質性，且與EGFR-TKI耐藥相關，同時EGFR-TKI治療又會促進腫瘤異質性的演進；其次，靶向治療耐藥后檢測到的相關耐藥突變并不一定能全面反應體內腫瘤的耐藥狀況，在制定后續(xù)治療方案時應考慮異質性的影響。

最后，本研究雖從細胞層面證實了NSCLC腫瘤異質性的存在，并探討了異質性與吉非替尼耐藥的關系，但尚缺乏體內實驗進行進一步驗證，值得進一步研究。

綜上所述，NSCLC在增殖能力、藥物敏感性等表型層面和驅動基因等遺傳背景層面均存在明顯的克隆異質性，并且其克隆異質性與吉非替尼敏感性相關，在吉非替尼的作用下，腫瘤異質性呈現動態(tài)演進的變化。