耿僡臨，胡鵬程，翁艷

清華大學第一附屬醫(yī)院，北京100016

肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是具有共同神經(jīng)內(nèi)分泌分化的肺腫瘤的一個亞型，包括典型和非典型類癌、小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，其形態(tài)學、免疫組織化學和分子特征均不同，臨床和生物學行為也有很大差異。典型類癌呈低度惡性，非典型類癌中度惡性，小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌高度惡性，無論是從病理學、遺傳學或臨床表現(xiàn)上，都難以明確區(qū)分[1-2]。肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生發(fā)展與許多因素有關，目前研究較多的主要涉及基因、微小RNA、信號通路等?，F(xiàn)將肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關基因、微小RNA、信號通路的調(diào)控作用研究進展綜述如下。

1 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關基因的調(diào)控作用

肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起調(diào)控作用的相關基因主要有細胞周期調(diào)控基因、染色質(zhì)重構(gòu)基因、Yes相關蛋白1(YAP1)基因、MYC家族基因、BCL2家族基因、p130基因。

1.1 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中細胞周期調(diào)控基因的調(diào)控作用 在肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，細胞周期調(diào)控基因RB1和TP53在癌中的突變明顯高于類癌。RB1基因在所有的肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中均有缺失，主要見于小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌。TP53基因的缺失在肺高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中很常見，在類癌中很少出現(xiàn)[4]。在大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中，TP53和RB1基因缺失率也較高，但RB1基因的缺失頻率低于小細胞肺癌[5]。小細胞肺癌具有典型的RB1和TP53基因突變，RB1雙等位基因缺失在小細胞肺癌或鱗狀細胞癌患者中常見。在體外ASCL1(achaete-scute complex-like 1)基因克隆中，RB通過三個不同位點的絲氨酸廣泛磷酸化而失活。RB基因失活后，E2F1因子被釋放，引導p53介導的細胞凋亡。因此，Ser795磷酸化具有重要的功能，因為它是抑制E2F1與RB結(jié)合的最有效位點。腫瘤細胞可以通過獲得TP53基因突變來規(guī)避這一機制。在細胞周期中，細胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)介導RB的磷酸化。在ASCL1過表達時，CDK5表達上調(diào)，ASCL1和CDK5在肺癌細胞中存在直接相互作用，ASCL1通過活化的CDK5刺激細胞遷移，CDK5能夠在有絲分裂后的神經(jīng)元中使RB磷酸化，使細胞周期重新進入和增殖。我們發(fā)現(xiàn)，ASCL1過表達導致CD56在體外表達，在小細胞肺癌中，ASCL1表達可能與RB和p53缺失共同存在，RB1基因缺失與神經(jīng)內(nèi)分泌分化的增殖增高和NOTCH基因突變失活有直接關系[6]。

1.2 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中染色質(zhì)重構(gòu)基因的調(diào)控作用 染色質(zhì)重構(gòu)基因在腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用，這些基因的突變是肺類癌發(fā)生的一個驅(qū)動因素。染色質(zhì)重構(gòu)基因包括內(nèi)共價組蛋白修飾因子和SWI-SNF復合物亞基，是目前發(fā)現(xiàn)的在肺的類癌和癌中突變率最高的基因組。研究[4]表明，KMT2基因家族共價組蛋白修飾因子(KMT2A、KMT2C和KMT2D)和SWI-SNF復合物(ARID1A、ARID1B和ARID2)在類癌和癌中突變率相近。另有研究[7]表明，染色質(zhì)修飾因子是所有肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)病機制中的主要參與者，在類癌中的作用可能更為明顯，因為類癌具有低突變背景，而神經(jīng)內(nèi)分泌癌則具有高突變背景和特征性的細胞周期調(diào)控基因TP53和RB1缺失。最常見的突變基因是MEN1、PSIP1和SFRS1相互作用蛋白1、ARID1A。類癌細胞中MEN1、PSIP1和ARID1A常發(fā)生基因突變，MEN1基因突變幾乎只存在于類癌中[4,7]。在另一項研究中，KMT2D在8%的小細胞肺癌腫瘤組織和17%的小細胞肺癌細胞系中出現(xiàn)無義/移碼/剪接位點突變。小細胞肺癌細胞系中的這些突變與賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2D蛋白水平降低和組蛋白H3賴氨酸-4的單甲基化降低有關，而單甲基化降低與轉(zhuǎn)錄因子增強有關[8]。在生存分析中，MEN1突變與非典型類癌的預后不良相關，KMT2D與小細胞肺癌的預后具有相關性，小細胞肺癌患者KMT2D的突變與較長的生存期相關[4]。

1.3 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中YAP1基因的調(diào)控作用 YAP1基因是Hippo通路中與肺癌發(fā)病相關的癌基因，可作為新的神經(jīng)內(nèi)分泌標志物，對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療具有潛在的預測作用。YAP1基因的缺失與神經(jīng)內(nèi)分泌標志物的強表達有關。ASCL1的表達可能導致YAP1的缺失，ASCL1通過激活miR375對YAP1的下調(diào)，抑制了細胞凋亡。RAB3A是一種突觸囊泡特異性蛋白，在正常神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和惡性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中特異性表達，而YAP1基因的缺失誘導了神經(jīng)內(nèi)分泌標志物RAB3A的表達，提示YAP1基因參與了神經(jīng)內(nèi)分泌分化的調(diào)控。YAP1基因缺失的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤可能是高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的一個獨特的亞型，這些腫瘤強表達神經(jīng)內(nèi)分泌標志物，對化療敏感，因此，檢測YAP1基因的表達可將高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分為化療敏感性和抗藥性兩種類型。在YAP1陽性的高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，出現(xiàn)藥物不良反應的程度可能超過鉑類化療的治療效果。然而，YAP1基因的缺失不是高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤特有的，而在所有的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中均常見。近年來，YAP1基因也作為檢測各種腫瘤對鉑類藥物耐藥性的重要標志物，包括非小細胞肺癌、口腔癌、宮頸癌、甲狀腺癌和卵巢癌[9]。

1.4 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中MYC家族基因的調(diào)控作用 MYC家族基因包括MYC、MYCL和MYCN，是在小細胞肺癌中反復出現(xiàn)異常的致癌基因，可作為小細胞肺癌新的治療靶點。MYC家族成員是基本螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，與標準E-box DNA元件CACGTG結(jié)合，與bHLH小蛋白MAX以異源二聚體的形式激活靶基因表達。MYC家族成員具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，如啟動轉(zhuǎn)錄機制的反式激活結(jié)構(gòu)域、E-box特異性DNA結(jié)合的基本結(jié)構(gòu)域、參與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和功能調(diào)控的MYC同源盒(MB)以及參與MAX二聚體化的C-末端HLH-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。MYC家族成員個體的擴增與小細胞肺癌的表型差異有關。研究[10]表明，不同的MYC家族成員決定了腫瘤對Aurora激酶(AURK)抑制劑阿利澤替布的敏感性，其中MYC擴增的小細胞肺癌細胞最敏感。另外，最近研究的CHK1抑制劑是另一個藥物靶點，MYC擴增的小細胞肺癌對CHK1抑制更加敏感，表明MYC的狀態(tài)是小細胞肺癌治療反應的重要決定因素。MYC通過幾種機制激活基因轉(zhuǎn)錄，包括基礎轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白乙?；?、染色質(zhì)重塑和RNA聚合酶的增加。MYC完全擴增現(xiàn)有基因的表達模式，而不是專門誘導一組不同的靶基因，因此，不同細胞類型之間MYC效應存在差異。除了轉(zhuǎn)錄作用外，MYC還通過與復制起始復合體相互作用，促進CDC45的表達，MYC的過表達誘導激活DNA損傷反應，導致基因組不穩(wěn)定性增加。CDK7是一種能磷酸化Pol Ⅱ的周期蛋白依賴性激酶，是小細胞肺癌的一種新的治療靶點，與非小細胞肺癌相比，小細胞肺癌對CDK7抑制劑THZ1的敏感性增加，因為CDK7抑制劑作用于調(diào)節(jié)MYC家族成員的小細胞肺癌特異性增強子，導致MYC和MYCN水平下降。在小細胞肺癌的細胞系中發(fā)現(xiàn)了MYCL兩種差異顯著的轉(zhuǎn)錄表達，短亞型缺乏HLH結(jié)構(gòu)域；MYCL的過表達結(jié)合Trp53和RB1的缺失，可顯著降低腫瘤潛伏期，促進了高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的腫瘤，這些腫瘤最初對化療敏感，隨后易復發(fā)。然而，MYCL基因的缺失明顯抑制腫瘤的形成，導致混合型和非小細胞肺癌的形態(tài)學改變，表明MYCL除了促進增殖外，還可能在小細胞肺癌的分化中發(fā)揮作用。MYCN在小細胞肺癌患者和小細胞肺癌細胞系出現(xiàn)擴增，但尚未明確其與經(jīng)典或變異型組織病理學形態(tài)以及治療反應的關系[10-11]。

1.5 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中BCL2家族基因的調(diào)控作用 逃避細胞凋亡是癌癥的特征，BCL2家族成員如BCL2相關的BAX和BCL2，通過促進或阻礙細胞凋亡積極參與這個過程。研究[3]表明，在肺的大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中，BCL2表達高，而在小細胞肺癌中，磷酸化的BCL2(pBCL2)表達高，在類癌中均呈低表達，BCL2在類癌組織中的表達明顯低于癌組織。在另一項研究[12]中，BCL2/BAX比值在典型和非典型類癌、小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中均有增加。較高的pBCL2水平與肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的無進展生存率和總生存率呈負相關[3,12]。

1.6 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中p130基因的調(diào)控作用 p130基因是細胞周期調(diào)控因子，引導檢測體內(nèi)雙重突變和三重突變腫瘤細胞的增殖狀態(tài)。細胞周期標志物Ki-67和S期標志物PCNA、MCM6的免疫組化染色顯示，雙重突變體細胞和三重突變體細胞均增殖活躍。在小細胞肺癌中，p130通過限制Rb/p53突變細胞的增殖而抑制腫瘤生長，起到關鍵的抑癌作用。p130功能的喪失導致小細胞肺癌細胞增殖增加，在Rb和p53基因缺失的情況下，p130基因的缺失加速了腫瘤的發(fā)展，并保持了小細胞肺癌的組織病理學特征和分子特征。Rb/p53/p130聯(lián)合突變?yōu)閷ふ抑委熜〖毎伟┑男掳悬c提供了臨床思路[13]。

2 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關miRNA的調(diào)控作用

miRNAs是短的、非編碼的、高度保守的單鏈RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，抑制基因表達，調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡[14]。miRNAs在肺癌發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和治療中具有重要作用，其易檢測，具有極高的特異性，在切除的腫瘤標本或細針穿刺標本中測量的miRNAs已經(jīng)成為腫瘤診斷、預測預后和治療反應的有效生物標志物[15]。特異性miRNAs的表達分析對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有診斷和/或預測價值。肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的不同亞型在miRNAs表達譜上有顯著差異[16]。研究[17]顯示，miR375主要來源于腎上腺、甲狀腺、肺和腸黏膜的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，miR375-3p能誘導神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分化；肺低級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中miR375-3p水平高于肺非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織，然而，miR375-3尚不能區(qū)分不同類型的肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。miR205-5p在鑒別肺腺癌和鱗狀細胞癌中有一定價值，然而，在鑒別其他類型的肺腫瘤(如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤)中miR205-5p的診斷價值尚不明確[17]。研究[16]顯示，miR-22、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-367、miR-504、miR-513C、miR-1200、miR-18a、miR-15b、miR-335、miR-1201與腫瘤生物學分級呈負相關，miRNAs let-7d、miR-19、miR-576-5p、miR-340、miR-1286與患者的生存期顯著相關，miR-29家族的成員在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中有極其重要的作用。

3 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關信號通路的調(diào)控作用

3.1 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的調(diào)控作用 哺乳動物mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/p70S6K信號通路中的主要蛋白激酶，它從氨基酸、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和環(huán)境因子中獲取信息，調(diào)節(jié)各種基本細胞過程，包括蛋白質(zhì)合成、生長、代謝、衰老、再生、自噬等，參與細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生和血管生成[1]，在包括神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了mTOR和mTOR相關激酶的正常活性改變和mTOR信號通路的失調(diào)。mTOR在癌中常被激活[18]，為腫瘤治療提供了一個潛在靶點。mTOR抑制劑是一種常用的免疫抑制劑，如依維莫司，已應用于胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的治療中，最近的臨床試驗結(jié)果表明mTOR抑制劑在類癌的治療中也有價值[19]。mTOR蛋白由兩個不同的多亞基復合體mTORC1與mTORC2組成。mTORC1復合體被多種刺激因素激活，如生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)、能量、應激信號以及重要的信號通路(如PI3K和MAPK)，從而控制細胞的生長和增殖。mTORC1也能激活S6K1和4EBP1這兩種蛋白參與mRNA的翻譯。mTORC2復合物抵抗雷帕霉素的抑制活性，對營養(yǎng)依賴和能量依賴信號通常不敏感，它能激活PKC-α和Akt，并調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架。mTOR信號通路的異常在癌中常見，包括PI3K擴增/突變、PTEN功能喪失、Akt過表達，S6K1、4EBP1和eIF4E過表達。mTOR信號通路成分表達的改變在腫瘤進展中起著重要作用[20]。mTOR信號通路的異常與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生密切相關，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中也存在mTOR通路成分表達的改變，并與臨床預后有關。針對mTOR通路的治療已成為一種有效的治療策略，使用mTOR抑制劑依維莫司治療胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤與改善患者的無進展生存期(PFS)有關。盡管依維莫司可以減緩腫瘤的進展，但顯著的腫瘤減少較少見。針對多種信號通路異常的治療是一種治療策略，可以提供更好的腫瘤控制和克服與單一途徑相關的耐藥機制，使用mTOR抑制劑與其他靶向藥物，如VEGF通路抑制劑和細胞毒性化療聯(lián)合治療晚期神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有更好的效果[21]。生長抑素受體2、多巴胺受體2和p70S6K(非磷酸化和磷酸化)蛋白在大多數(shù)典型肺類癌組織中表達。單獨使用奧曲肽和卡麥角林并不足以阻斷細胞活性，但這兩種藥物與mTOR抑制劑聯(lián)合使用可減少mTOR抑制劑誘導的逃逸機制，激活內(nèi)源性mTOR抑制，增強mTOR抑制劑在典型肺類癌中的作用[22]。大多數(shù)支氣管肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(BP-NETs)表達p-AKT和p-mTOR，提示AKT/mTOR通路在這些腫瘤中起重要作用[23]。除總mTOR水平外，反映支氣管類癌對mTOR抑制劑敏感性的標記物還包括AKT、p70S6K(RPS6KB2)和ERK1/2(MAPK3/1)蛋白水平，表明雙重PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235在抑制支氣管類癌細胞增殖方面比依維莫司更有效，“耐藥”細胞表現(xiàn)出較低的mTOR、p70S6K、AKT和ERK1/2水平，表明這些蛋白質(zhì)可以作為人類支氣管類癌中對mTOR和PI3K/mTOR抑制劑耐藥性的預測標志物[24]。在小細胞肺癌中檢測到PI3K-AKT-mTOR信號通路編碼基因的高頻率基因拷貝數(shù)改變。在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的AKT和mTOR表達的免疫組化研究中，大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)了磷酸化AKT和mTOR，提示這種途徑在致神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中起著核心作用，這些分子在類癌中的表達高于小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌。mTOR的表達與小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的腫瘤分期呈負相關，T1-T2期腫瘤的mTOR磷酸化水平高于T3-T4期腫瘤。高級別和更具侵略性的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有不同于低級別和中級別腫瘤的分子特征，肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌具有與小細胞肺癌相似的基因組特征，包括潛在的治療靶點，如PI3K/AKT/mTOR通路和其他基因改變，具有診斷和治療的臨床意義[5, 25]。針對mTOR通路的靶向治療是一種可行的治療策略。雷帕霉素在體外(BON-1、H727和MTC細胞系)和BON-1異種移植模型中均具有減少類癌增殖的作用。在人類原發(fā)性支氣管類癌細胞培養(yǎng)中，依維莫司已被證明可以減少血管內(nèi)皮生長因子的分泌和細胞活性。在小細胞肺癌細胞中，真核起始因子4E(elF4E)的高表達與增強對依維莫司治療的耐藥性有關。由MYC介導的elF4E信號轉(zhuǎn)導通路與mTOR的激活是一種促進依維莫司耐藥的機制，并為其抑制作用的進一步研究提供了理論基礎[26]。

3.2 肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中NOTCH信號通路的調(diào)控作用 NOTCH受體在某些情況下可以作為癌基因，在另一些情況下可以作為抑癌基因[27]。NOTCH1信號通路在細胞周期轉(zhuǎn)運中起重要作用，參與呼吸系統(tǒng)和胃腸道細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌分化。NOTCH1調(diào)節(jié)類癌細胞生長和神經(jīng)內(nèi)分泌表型[28]。研究[29]表明，NOTCH1信號通路通常不存在于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，而NOTCH1信號通路的激活可以顯著減少腫瘤的生長。重新激活NOTCH信號通路可能是小細胞肺癌患者的一種治療策略。ASCL1是NOTCH信號通路抑制的靶點，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括小細胞肺癌)中ASCL1的表達增加，促進腫瘤生長，而NOTCH1信號通路降低了這種表達。ASCL1對高級別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的特異性高于類癌。一個失活的NOTCH突變足以誘導非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞或腫瘤前體細胞向神經(jīng)內(nèi)分泌分化。然而，多個NOTCH受體失活增加了原發(fā)性小細胞肺癌的可能性。NOTCH信號通路失活，隨后ASCL1上調(diào)，RB1和TP53的同時突變放大激活Wnt級聯(lián)，促進了繼發(fā)性小細胞肺癌。在小細胞肺癌中，NOTCH1通路失活上調(diào)導致細胞生長抑制和神經(jīng)內(nèi)皮細胞分化，并誘導細胞系出現(xiàn)上皮樣形態(tài)[6,26]。ASCL1還調(diào)節(jié)NOTCH通路中的多個基因，包括DLL3[30]。NOTCH信號通路中的另一成員，NOTCH3信號在肺癌中的表達依賴于細胞類型。研究[31]顯示，NOTCH3在小細胞肺癌中表現(xiàn)為腫瘤抑制通路，而在非小細胞肺癌中表現(xiàn)為腫瘤促進通路。

綜上所述，肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程受細胞周期調(diào)控基因、染色質(zhì)重構(gòu)基因、YAP1基因、MYC家族、BCL2家族、p130基因，腫瘤相關的miRNAs以及腫瘤相關的通路(mTOR信號通路、NOTCH信號通路)的調(diào)控，這些分子靶點在臨床診斷和治療上均有重要作用。但這些研究還尚未完善，因此，還需更大量的肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分子生物學研究，進行相關的臨床試驗，進一步探索分子靶點在腫瘤診斷、治療及預后中的作用，為肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的病理學分型及臨床靶向治療提供更準確、更有效的依據(jù)。