郝繁運(yùn)

CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)可用于氯吡格雷等藥物用藥安全監(jiān)測(cè)和用藥指導(dǎo)，ApoE基因分型檢測(cè)結(jié)果可以作為心腦血管疾病及阿爾茲海默病（Alzheimer's disease，AD）臨床輔助診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要指標(biāo)。CYP2C19基因多態(tài)性和ApoE基因分型檢測(cè)已被越來(lái)越多的臨床醫(yī)師重視，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性和ApoE基因分型至關(guān)重要，但目前在臨床檢測(cè)工作中缺少準(zhǔn)確可靠的商用質(zhì)量控制（質(zhì)控）品，因此，本研究使用醫(yī)院血庫(kù)制備濾膜的收集物，進(jìn)行基因檢測(cè)質(zhì)控品的研制，取得預(yù)期效果［1-4］，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 自制質(zhì)控品的標(biāo)本來(lái)源

為獲得穩(wěn)定的質(zhì)控品來(lái)源，本研究對(duì)醫(yī)院血庫(kù)制備“去白細(xì)胞紅細(xì)胞”后棄留在過濾器濾膜上的白細(xì)胞進(jìn)行提取［5］，作為自制質(zhì)控品的標(biāo)本來(lái)源。自制質(zhì)控品采用來(lái)自健康獻(xiàn)血者的標(biāo)本，而非提取后的DNA，目的在于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)全流程質(zhì)控，包括核酸提取階段和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）階段。

2 自制質(zhì)控品的制備與分型檢測(cè)

2.1 儀器與試劑 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（已校準(zhǔn)，該檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)通過性能驗(yàn)證和室間準(zhǔn)確性比對(duì)）；CYP2C19基因多態(tài)性試劑盒（批號(hào)：20181001H，武漢海吉力生物科技有限公司），ApoE基因分型試劑盒（批號(hào)：AE201811005，廈門人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司）。

2.2 標(biāo)本收集 使用無(wú)菌生理鹽水沖洗去白細(xì)胞過濾器，采用無(wú)菌操作將洗滌下來(lái)的液體小心收集在50 mL離心管中備用，總量約50 mL，取0.5 mL樣本在血液分析儀中進(jìn)行測(cè)定，以白細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到5.0×109/L為合格。本次實(shí)驗(yàn)共收集標(biāo)本28份，測(cè)得白細(xì)胞計(jì)數(shù)都在10×109/L以上。

2.3 收集標(biāo)本盲測(cè) 將收集的28份標(biāo)本使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因測(cè)試分型，采用CYP2C19基因多態(tài)性試劑盒和ApoE基因分型試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 CYP2C19基因多態(tài)性的判斷 本實(shí)驗(yàn)采用的基因擴(kuò)增試劑每個(gè)標(biāo)本占據(jù)1條6連管。選擇1、2號(hào)管，根據(jù)每個(gè)反應(yīng)管到達(dá)FAM通道（450～490 nm）信號(hào)閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)差值（?Ct值）判斷樣本CYP2C19*2的基因多態(tài)性；選擇3、4號(hào)管，根據(jù)FAM信號(hào)?Ct值判斷樣本CYP2C19*3的基因多態(tài)性；選擇5、6號(hào)管，根據(jù)FAM信號(hào)?Ct值判斷樣本CYP2C19*17的基因多態(tài)性，然后根據(jù)表1判斷標(biāo)本的基因型。對(duì)分裝的自制質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取后按照基因擴(kuò)增操作程序在PCR儀上機(jī)檢測(cè)。

表1 CYP2C19基因多態(tài)性分型判斷

2.3.2 ApoE基因分型判斷 待測(cè)樣品DNA內(nèi)控HEX通道（515～535 nm）信號(hào)正常時(shí)觀察樣品在ε2、ε3和ε4基因檢測(cè)試劑中的FAM信號(hào)有無(wú)曲線升起。如有擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct和?Ct值（?Ct＝CtFAM-CtHEX），以≤?Ct臨界值判斷為陽(yáng)性。見表2。

本研究篩選出25份符合要求樣本，CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)出*1/*1基因型10份，*1/*2基因型10份，*2/*2基因型3份，*1/*3基因型1份，*3/*3基因型 1份，未檢出 *1/*17、*2/*3、*2/*17、*3/*17、*17/*17基因型；篩選出27份符合要求樣本中ApoE基因分型檢測(cè)出ε3/ε3基因型19份，ε3/ε4基因型2份，ε2/ε3基因型4份，ε2/ε2基因型1份，ε4/ε4基因型1份，未檢出ε2/ε4基因型。

表2 ApoE基因分型判斷

2.4 自制質(zhì)控品的制備

2.4.1 CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)質(zhì)控品的制備取上述不同基因型（*1/*2、*2/*2、*1/*3、*3/*3）的陽(yáng)性標(biāo)本，分別顛倒混勻10次。室溫下以2 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心30 min。然后用一次性塑料吸管小心吸出位于紅細(xì)胞和血漿層中間的白細(xì)胞層（白膜），置于5 mL雙蒸水（ddH2O）中，顛倒混勻后靜置10 min，使吸出的少量紅細(xì)胞低滲溶血，以3 500 r/min離心15 min；吸棄上清，保留細(xì)胞層，視溶血效果可重復(fù)低滲溶血操作1～2次。合并相同基因型的白細(xì)胞，以適量（按原血標(biāo)本總體積的1/2）模擬血漿重懸。充分混勻后按照每管不少于200 μL分裝到0.5 mL離心管中，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 ApoE基因分型檢測(cè)質(zhì)控品的制備 取上述不同基因型（ε3/ε4、ε2/ε3、ε3/ε3、ε4/ε4）的陽(yáng)性標(biāo)本，按照2.4.1項(xiàng)下方法制備ApoE基因分型檢測(cè)質(zhì)控品并分裝，于-70 ℃保存。

2.5 自制質(zhì)控品的分裝 上述自制質(zhì)控品按6個(gè)月量進(jìn)行配制。用0.5 mL離心管分裝，每支分裝量應(yīng)足夠進(jìn)行至少1次檢測(cè)，在質(zhì)控品外部粘貼標(biāo)簽，需注明質(zhì)控品名稱、配制日期、有效期及配制人。

3 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)自制質(zhì)控品的方式和頻率

3.1 每日取1支自制質(zhì)控品作為外部陽(yáng)性質(zhì)控（不同基因型交替輪換使用），隨日常標(biāo)本進(jìn)行核酸提取及PCR上機(jī)檢測(cè)，外部陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)本位置隨機(jī)。每塊反應(yīng)板均需運(yùn)行室內(nèi)質(zhì)控，包括試劑盒自帶的陰性、陽(yáng)性質(zhì)控以及空白對(duì)照，自制質(zhì)控品每日檢測(cè)1次。

3.2 根據(jù)室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果與已知結(jié)果的一致性判斷本批次結(jié)果是否正常，報(bào)告能否發(fā)出。

4 自制質(zhì)控品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)估［6-7］

4.1 均勻性評(píng)估 每批新制質(zhì)控品均需進(jìn)行1次均勻性評(píng)價(jià)，每個(gè)基因型質(zhì)控品配制成一定濃度后混勻分裝并上機(jī)檢測(cè)，以不同瓶間無(wú)明顯差別（本實(shí)驗(yàn)為判定分型結(jié)果一致）作為均勻性評(píng)價(jià)指標(biāo)。每個(gè)分型標(biāo)本取5瓶在1 d內(nèi)進(jìn)行核酸提取后擴(kuò)增檢測(cè)，根據(jù)試劑盒要求判讀結(jié)果，定型結(jié)果與已知結(jié)果一致為合格。見表3～4。

表3 CYP2C19基因多態(tài)性自制質(zhì)控品同批次均勻性結(jié)果

表4 ApoE基因分型自制質(zhì)控品同批次均勻性結(jié)果

4.2 穩(wěn)定性評(píng)估 將自制質(zhì)控品保存于-70 ℃，每批次選取3瓶進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，記錄第0、1、3、6個(gè)月后檢測(cè)結(jié)果，與預(yù)期陽(yáng)性結(jié)果一致則為穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定期為檢測(cè)時(shí)間，否則將上一次檢測(cè)時(shí)間作為穩(wěn)定時(shí)間。見表5～6。

表5 CYP2C19基因多態(tài)性自制質(zhì)控品階段性復(fù)測(cè)結(jié)果

表6 ApoE基因分型自制質(zhì)控品階段性復(fù)測(cè)結(jié)果

4.3 穩(wěn)定性回顧評(píng)價(jià)［8-10］定期對(duì)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行回顧性評(píng)價(jià)，每月質(zhì)控小結(jié)回顧首先確認(rèn)質(zhì)控品的有效性。如果自制質(zhì)控品Ct值有降低趨勢(shì)，或無(wú)明確原因與預(yù)期結(jié)果不一致，則需停止使用并重新確認(rèn)該批次質(zhì)控品的有效性，更換新批次的質(zhì)控品。

自制室內(nèi)質(zhì)控品在PCR擴(kuò)增儀中的位置不能永久固定在1個(gè)孔，應(yīng)盡量在每次擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)進(jìn)行相應(yīng)順延，使得在一定時(shí)間內(nèi)可以盡可能地監(jiān)測(cè)每1個(gè)孔的擴(kuò)增有效性。

5 討論

本研究以醫(yī)院血庫(kù)制備“去白細(xì)胞紅細(xì)胞”后棄留在濾膜上的白細(xì)胞作為原料，對(duì)其進(jìn)行提取，自制基因檢測(cè)質(zhì)控品，結(jié)果顯示，自制質(zhì)控品的均勻性和穩(wěn)定性符合預(yù)期質(zhì)量要求。并且可獲得穩(wěn)定充足的樣本，克服通過其他渠道獲得樣本來(lái)源有限、不能有效監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)全過程等缺點(diǎn)，制備的質(zhì)控品在臨床實(shí)驗(yàn)室中可用于ApoE基因分型和CYP2C19多態(tài)性檢測(cè)。自制質(zhì)控品需較長(zhǎng)時(shí)間凍存，本研究未加入甘油、二甲基亞砜、血清等外源性保護(hù)劑和穩(wěn)定劑，可以避免檢測(cè)中可能存在的非特異性干擾。

利益沖突 作者聲明不存在利益沖突