劉 煥，楊 卓，張麗麗，鄭 琪，張小紅，閔東紅

(1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/生命學院，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 2.陜西省農(nóng)牧良種場，陜西寶雞 722203)

異三聚體G蛋白(Gα,Gβ/Gγ)偶聯(lián)受體簡稱G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)，是數(shù)量最大的一類膜蛋白受體，廣泛存在于動物、真菌與植物中[1-3]。近年來在植物中，研究者主要在擬南芥[4-5]、水稻[6]、豌豆[7]、楊樹[8]、大豆[9]、蘋果[10]以及玉米[11]中發(fā)現(xiàn)GPCRs，并對其功能進行了研究。前人研究結(jié)果表明，GPCRs參與植物的信號轉(zhuǎn)導過程并影響植物的生長發(fā)育，主要包括調(diào)控ABA信號通路[12]、參與CK信號轉(zhuǎn)導[13-14]、調(diào)節(jié)細胞周期蛋白、DNA合成[15]、磷脂酰肌醇[16]、藍光信號轉(zhuǎn)導[17]以及細菌信號交流[18]。GPCRs除了介導植物信號分子影響植物的生長發(fā)育之外，還參與植物逆境脅迫反應。蘋果G蛋白偶聯(lián)受體基因MdGCR1在響應植物抗旱脅迫中發(fā)揮重要作用[9]；擬南芥GCR1參與多種生物和非生物脅迫響應，在磷酸鹽饑餓響應中發(fā)揮作用[19]，并會影響植物體內(nèi)脅迫基因的表達[17]；水稻G蛋白偶聯(lián)受體基因OsGPCR1，可以提高植株的耐冷性、耐鹽性以及抗旱性[20]，與其氨基酸序列同源性高達99.79%的同源基因COLD1，可以明顯的提高水稻的耐冷性[21]。目前，小麥GPCRs的研究主要集中在植株矮化[22]、禾谷鐮刀菌生長發(fā)育、毒性產(chǎn)生以及赤霉病菌致病等方面[23-24]，而對該類基因能否提高小麥耐冷性尚未見報道。同時，關于小麥G蛋白偶聯(lián)受體的作用機制亦不清楚，有待進一步研究。

作物在生長過程中會受到生物脅迫和非生物脅迫，其中溫度、干旱以及鹽害等非生物脅迫是影響作物生產(chǎn)最為重要的因素[25]。近年來，由低溫引起的小麥倒春寒頻發(fā)，對小麥生產(chǎn)造成嚴重的威脅，已成為小麥產(chǎn)量損失的主要災害之一。因此，挖掘小麥耐冷基因，研究小麥耐冷的分子機制，對于合理利用小麥耐冷基因，開展小麥耐冷基因工程改良，確保小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)具有重要現(xiàn)實 意義。

本研究采用同源克隆的方法得到水稻耐冷基因COLD1的同源基因TaCTR，利用生物信息學的方法對基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性以及進化關系進行初步分析，通過亞細胞定位技術對該基因表達的蛋白進行定位，利用qRT-PCR技術分析TaCTR在不同處理下的表達特性以及組織特異性等，以期為探究TaCTR的功能機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試普通小麥品種小偃22、周麥18、西農(nóng)979、13(36)0-7、西農(nóng)626、西農(nóng)611均由本實驗室保存，其中，小偃22是本研究的主要材料，其具有耐冷性突出、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和適應性廣等優(yōu)良性狀。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將飽滿的小偃22種子于2017年10月播種于田間，待發(fā)育至拔節(jié)期，選擇發(fā)育正常的植株移栽至室內(nèi)花盆，緩苗一周，待幼穗發(fā)育進入藥隔形成期至雌雄蕊分化時期，將其放入4 ℃春化培養(yǎng)間，分別在4 ℃冷處理0、0.5、1、2、5、8、12和24 h后，取根、莖、葉、幼穗等組織材料。將所取樣品迅速收集于2 mL離心管內(nèi)并置于液氮中，然后保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)熒光定量以及基因克隆。小麥拔節(jié)期取其雌雄蕊用于后續(xù)的組織 定量。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

小麥組織的總RNA提取采用TRNzol Universal總RNA提取法，具體提取步驟參照TRNzol Universal總RNA提取試劑(DP424)(天根，北京)說明書。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳(200 V，10 min)檢測提取總RNA的完整性，用NanoDropTMOne/OneC 超微量紫外分光光度計(賽默飛，美國)測定RNA的濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit(With gDNase)(KR116)(天根，北京)說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小麥TaCTR基因克隆

以水稻COLD1基因的cDNA序列為探針在 NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與六倍體小麥進行比對，得到開放閱讀框長度為 1 407 bp的序列，利用Primer 5.0設計引物TaCTR-F(5′-CGAGAAGCGAAGGGGGAGA-3′)/ TaCTR-R(5′-AACCCCCTTTGTGAACT GACTTTA-3′)。以小麥幼穗cDNA為模板，利用PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase with GC Buffer(R044A)(TaKaRa，日本)進行PCR擴增。擴增體系及其操作步驟詳見說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為59.5 ℃，延伸時間為1 min 45 s。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (DP219)(天根，北京)純化回收。利用PLB零背景快速連接試劑盒(VT205)(天根，北京)將目的基因連接到載體PLB載體上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞(天根，北京)，挑取單克隆進行陽性檢測并測序。引物合成及測序均在奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2.4 生物信息學分析

以小麥TaCTR的氨基酸序列為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫 BLAST，下載與其相似度>85%的其他物種的同源蛋白序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用MEME 5.1.0(http://meme-suite.org/tools/meme )分析氨基酸保守序列，并用evolview-v2(https://evolgenius.info//evolview-v2)整合進化樹與氨基酸保守序列；用SwissProt(https://swissmodel.expasy.org/)和ExPASy(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool )在線分析TaCTR蛋白的理化性質(zhì)；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )工具預測TaCTR蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位；用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點分析；用SMART(http://smart.embl-hei-delberg.de/)在線分析TaCTR蛋白的功能域。

1.2.5TaCTR基因的亞細胞定位

對亞細胞定位載體pCAMBIA1302-EGFP進行BstBI單酶切，酶切產(chǎn)物回收，利用引物TaCTR-GFP-F(5′-CGAGCTCAAGCTTCGAA ATGGGGTGGGGCGTGGTG-3′)/TaCTR-GFP-R(5′-CGTCGACTGCAGAATTCGAAATCAATT GGATGCTT-3′)擴增目的基因。按照ClonExpressTMOne Step Cloning Kit試劑盒說明書(諾唯贊，南京)將酶切產(chǎn)物與TaCTR目的片段連接，轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行陽性檢測并測序。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101，挑取單克隆，取1 mL菌液置于50 mL含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng) 16～18 h，使OD600=1.0； 5 000 r·min-1離心5 min；用懸浮緩沖液分別懸浮pCAMBIA1302-EGFP-TaCTR和pCAMBIA 1302-EGFP菌液沉淀，使OD600=0.6～0.8，室溫靜置3 h，對生長4周的本氏煙草進行全葉片注射； 60 h后制備已注射菌液煙草的原生質(zhì)體，觀察蛋白表達。

1.2.6TaCTR基因的表達模式分析

根據(jù)TaCTR基因cDNA序列，避開TaCTR的保守區(qū)，利用Primer 5.0設計引物RT-TaCTR-F(5′-CCTCCCCTACTACCACTGCT-3′)/RT-TaCTR-R(5′-CGCCAATCCTACTAA CCAAC-3′)，用于檢測TaCTR的表達；以β-Actin(AB181991)為內(nèi)參基因，所用引物為Actin-F(5′-CGATTCAGAGCAGCGTATTGTTG-3′)/Actin-R(5′-AGTTGGTCGGGTCTCTTCTAA ATG-3′)。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板濃度均稀釋到200 ng·μL-1，利用SuperReal熒光定量預混試劑彩色版(SYBR Green)(FP215)試劑盒進行定量分析，在熒光定量PCR儀(ABI7500)上進行實時熒光定量PCR 反應。反應體系及程序參見說明書。每個反應3次重復，采用2-ΔΔCT方法分析TaCTR在不同小麥品種中的表達、組織表達特異性以及脅迫和激素處理后的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥耐冷基因TaCTR的克隆結(jié)果

對4 ℃冷處理小偃22幼穗組織進行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，在冷處理5 h內(nèi)，TaCTR基因的表達量處于上升趨勢，5 h時表達量達到最大，大約是0 h的11.16倍，存在顯著性差異，之后逐漸下降(圖1)。以冷處理5 h的小偃22幼穗的cDNA為模板，利用引物TaCTR-F/TaCTR-R進行擴增，擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一個片段大小為1 407 bp的特異性條帶(圖2)。將目的片段回收后，連接至PLB零背景克隆載體，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌后挑取單克隆進行菌液檢測，并對陽性單克隆進行測序分析。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明，TaCTR分別位于小麥2A、2B和2D染色體上，并且與2D染色體上的序列完全相同。TaCTR基因序列全長2 192 bp，開放閱讀框長1 407 bp，共編碼468個氨基酸殘基，分子量為53.43 kDa。DNAMAN序列比對分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，TaCTR在2A、2B和2D染色體間具有高度保守性，且功能域相同，三者所編碼的氨基酸序列同源性高達99.64%，僅在第5、92位存在差異，在第5位(紅色邊框)，2A染色體上對應的為蘇氨酸，2B和2D染色體上為纈氨酸；第92位(藍色邊框)，2B染色體上對應的為纈氨酸，2A和2D染色體上為亮氨酸。因此，推斷該基因在2A、2B和2D染色體上具有相似的功能，本研究以2D染色體上的基因進行后續(xù)試驗。

圖柱上不同小寫字母表示不同脅迫時間之間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 TaCTR基因的生物信息學分析

2.2.1TaCTR基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

蛋白系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖4)表明，單子葉植物與雙子葉植物分別聚為一類，小麥TaCTR蛋白與單子葉植物處于同一進化分支，且與粗山羊草的親緣關系最近，這可能是由于小麥的2D染色體來自于粗山羊草的緣故。分析不同物種間CTR蛋白的氨基酸保守序列發(fā)現(xiàn)，無論雙子葉還是單子葉植物，CTR蛋白均含有motif 1、2、3、4和5，而且這5個motif的大小和位置接近，這說明TaCTR基因在不同物種間具有較好的保 守性。

M:DL2000；1～3：TaCTR PCR產(chǎn)物。

紅色邊框：第5位氨基酸；藍色邊框：第92位氨基酸；紅線：GPHR_N功能域；藍色：ABA_GPCR功能域。

2.2.2TaCTR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)分析

TaCTR蛋白分子式為C2488H3886N622O643S21，分子量為53.43 kDa,理論等電點PI為9.23，屬于堿性蛋白?？偲骄H水性值為 0.462，表明該蛋白屬于疏水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為40.54，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。通過SOPMA在線預測分析TaCTR的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要包括α螺旋(alpha helix)，無規(guī)則卷曲(random coil)、延伸直鏈(extended strand)和β折疊(beta turn)四種結(jié)構(gòu)，其所占比例分別為66.88%、20.09%、 9.62%和3.42%。

2.2.3TaCTR基因編碼蛋白的跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點分析

通過TMHMM Server V.20在線預測，發(fā)現(xiàn)TaCTR蛋白存在9個跨膜區(qū)，屬于膜蛋白，每個跨膜區(qū)含20～23個氨基酸，對應位置分別為6～28 aa、41～63 aa、78～100 aa、113～132 aa、152～174 aa、297～319 aa、347～369 aa、390～409 aa、433～455 aa。通過SMART在線分析，發(fā)現(xiàn)TaCTR蛋白主要包括GPHR_N和ABA_GPCR兩個功能域，位置分別在143～210 aa和285～458 aa之間，長度為68 bp和174 bp。通過NetPhos 3.1 Server數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)TaCTR蛋白含有16個絲氨酸、6個蘇氨酸和1個酪氨酸磷酸化位點。

2.3 TaCTR蛋白的亞細胞定位

通過WoLF PSORT對TaCTR蛋白進行定位預測，發(fā)現(xiàn)其主要存在于細胞膜上。將含有重組載體pCAMBIA 1302-EGFP-TaCTR和空載體pCAMBIA 1302-EGFP的菌液同時注射煙草，并制備煙草原生質(zhì)體進行觀察。結(jié)果(圖5)表明，陽性對照pCAMBIA 1302-EGFP在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核均能觀察到熒光信號，含有目的基因TaCTR的重組載體pCAMBIA 1302-EGFP-TaCTR僅在細胞膜上具有較強的熒光信號，進一步證明TaCTR編碼的蛋白為膜蛋白。

2.4 TaCTR基因在不同小麥品種中的表達及組織特異性分析

分別取生長至三葉期的13(36)0-7、西農(nóng)626、西農(nóng)611、小偃22、周麥18、西農(nóng)979的幼苗葉片，對TaCTR的相對表達量進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其相對表達量依次分別為1.00、1.56、1.64、3.71、5.19、 1.61， 說明在小偃22和周麥18中TaCTR表達水平較高，這也進一步說明了小偃22具有較好的耐冷性，與多年的田間觀察結(jié)果相吻合。組織特異性表達水平(表1)顯示，TaCTR基因在小偃22的根、莖、葉、小穗以及雌雄蕊中均有表達，但在小穗和雌蕊中表達量較高，這與小麥表達網(wǎng)站W(wǎng)heat Expression Browser(http://www.wheat-expression.com/)預測結(jié)果一致。

圖4 TaCTR蛋白的系統(tǒng)進化樹(A)及氨基酸保守基序分析(B)Fig.4 Phylogenetic tree(A) and amino acid conserved motifs(B) analysis of TaCTR protein

Bar=50 μm圖5 TaCTR蛋白亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of TaCTR

2.5 非生物脅迫及激素處理對TaCTR基因表達量的影響

由表2可以看出，在NaCl脅迫處理下，TaCTR的表達量在0～4 h間隨時間推移呈上升趨勢，在處理4 h時表達量達到最大水平，為0 h的3.42倍，二者差異達到顯著水平(P<0.05)；4 h后，其表達量逐漸下降。在干旱處理下，TaCTR的相對表達量在處理48 h時最高，約是0 h的 2.05倍，二者差異達到顯著水平。在GA處理下，TaCTR的表達量在1 h時達到最高水平，為0 h的3.13倍，二者差異達到顯著性差異。以上結(jié)果說明，TaCTR的表達受干旱以及鹽脅迫的誘導，并且可能參與GA信號通路，因此，推測TaCTR參與植物的抗逆信號轉(zhuǎn)導。

表1 小偃22中TaCTR基因的組織特異性分析Table 1 Tissue-specific expression analysis of TaCTR in Xiaoyan 22

表2 不同處理對小偃22葉片中TaCTR基因表達量的影響Table 2 The effect of TaCTR expression in leaf of Xiaoyan 22 under different treatments

3 討 論

低溫、高溫、干旱以及鹽害是限制小麥生產(chǎn)的幾個主要非生物脅迫因子。其中，低溫冷害(春季倒春寒)已成為中國黃淮麥區(qū)影響小麥生產(chǎn)的重要災害之一。春季倒春寒常發(fā)生在2月下旬至4月上旬，大田小麥正處于拔節(jié)期，其穗分化進程正處于雌雄蕊分化期和藥隔發(fā)育時期，此時正是小麥幼穗對低溫較為敏感的時期[26]，也是小麥產(chǎn)量形成的關鍵時期。倒春寒的發(fā)生會導致小花停止發(fā)育、幼穗凍死，或麥穗上部和下部受凍嚴重，因而結(jié)實率明顯降低，造成小麥減產(chǎn)10%～50%左右[27]。

研究發(fā)現(xiàn)，受到低溫脅迫時，水稻COLD1基因與G蛋白α亞基相互作用，激活Ca2+通道，并增強G蛋白GTPase的活性，從而保護水稻避免低溫脅迫[21]。本研究利用同源克隆方法從小偃22中分離到水稻耐冷基因COLD1的同源基因TaCTR，兩者高度同源，均具有9個典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。TaCTR基因序列與中國春序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者相似度達到100%，說明該基因在不同的小麥品種之間具有很高的保守性，而且該基因在2A、2B和2D三個染色體組之間編碼蛋白的同源性達到99.64%，說明該基因在不同染色體組間也具有高度保守性。由于異源六倍體小麥的三個染色體組的部分同源基因可能是通過表達的差異來調(diào)控小麥的生長發(fā)育，其調(diào)控網(wǎng)絡復雜[28-29]，加之小麥基因可變剪切較為普遍，且涉及小麥發(fā)育、生理生化代謝和逆境脅迫響應等多個過程，導致異源六倍體小麥存在多個等位基因位點，致使小麥基因表達調(diào)控十分復雜[30-31]，關于TaCTR基因在普通小麥的具體表達模式與調(diào)控機制還有待進一步深入探討。

進化樹分析結(jié)果顯示，小麥TaCTR基因在單雙子葉中都存在同源基因，暗示了該基因在單雙子葉分化之前就已存在。該基因與粗山羊草之間的遺傳關系最近，表明該基因在小麥進化過程中由粗山羊草提供。至于該基因在單、雙子葉植物基因組中保守域無明顯差異，說明該基因在單、雙子葉分化演變中仍具有較高的保守性，但是具體的機制還需進一步探究。

組織特異性表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaCTR基因在小麥的各個部位均有不同程度的表達，這與水稻G蛋白偶聯(lián)受體基因OsGPCR的表達模式[20]以及擬南芥中基因GTG1/2的GUS染色結(jié)果一致[32]。TaCTR基因在小麥的小穗以及雌雄蕊中表達量較高，說明小麥在遭受春季低溫脅迫時，其小穗對低溫的反應最為敏感，最先做出相應的應激反應。亞細胞定位結(jié)果表明，該蛋白主要在細胞膜上，這與生物信息學分析結(jié)果以及水稻G蛋白偶聯(lián)受體基因OsGPCR的定位結(jié)果一致[20]，推測該基因編碼的蛋白與水稻OsGPCR編碼的蛋白在功能上具有相似性。而植物受到低溫脅迫時，細胞膜最先受到傷害，該基因定位于細胞質(zhì)膜上，這對其感受冷害信號具有重要意義。

Assman等[5]研究結(jié)果顯示，G蛋白偶聯(lián)受體是植物中存在的可能感受環(huán)境脅迫的受體分子。而TaCTR基因與水稻中編碼G蛋白偶聯(lián)受體的基因OsGPCR1具有高度同源性，并且與人體內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體HsGCR68以及擬南芥中的GPCR型G蛋白有著共同的GPHR_N和ABA_GPCR結(jié)構(gòu)域，并且均含有9個典型跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，推測TaCTR基因為小麥中一個潛在的G蛋白偶聯(lián)受體基因，在小麥的低溫信號轉(zhuǎn)導以及逆境脅迫中發(fā)揮著極其重要的作用。

在本研究中，對處于三葉期的小麥幼苗進行非生物脅迫以及激素處理后進行熒光定量試驗，結(jié)果顯示，TaCTR的表達在低溫、干旱以及高鹽脅迫時均上調(diào)表達，這與水稻基因OsGPCR1研究結(jié)果一致[20]。在GA處理下，TaCTR的表達量明顯上調(diào)，在水稻中發(fā)現(xiàn)COLD1與GA信號的關鍵元件D1/RGA1在功能上是相互關聯(lián)的[21]，而TaCTR與COLD1有著高度的同源性，這也暗示著小麥TaCTR與水稻COLD1有著相似的調(diào)控機制。